[发明专利]用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的分子标记、引物组合物、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的分子标记、引物组合物及检测试剂盒和应用，分子标记Spprotein singed46.156目的基因，引物组合物包括singed‑F和singed‑R。用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的试剂盒，包括引物组合物和缓冲液。Spprotein singed46.156目的基因具有潜在的蛋白结合功能，可能与该物种在退变过程中某种蛋白质的合成与降解有关，同时在不同发育时期差异表达显著；结合qRT‑PCR技术筛选出幼虫期发育时间推算的分子遗传标记，构建差异表达基因与发育时间的回归方程以进行不同发育阶段辅助判定，可用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间，为实际案件中PMI推断应用提供更加科学、客观、公正的数据参考。

技术领域

本发明涉及一种医药技术领域，具体涉及一种用于推算棕尾别麻蝇幼虫期发育时间的分子标记、引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术

法医昆虫学(Forensic entomology)是应用昆虫学知识解决有关法律问题的法医学分支科学，对死亡时间的推断，特别是腐败尸体的死亡后间隔时间 (postmorteminterval,PMI)的推断具有独特优势。利用嗜尸性蝇类非成虫期(卵、幼虫、蛹)的形态学变化特点结合环境温度等条件，判断其发育阶段和计算发育到该阶段所经历时间，是现有PMI推断的主要理论依据。嗜尸性蝇类在不同环境温度中生长发育速率存在明显差异，因此发育阶段的准确判断是 PMI推断中的关键环节，目前主要以1)直接法，即根据特定蝇类具有时序性变化的体长及体重等，结合尸体现场的环境温、湿度等数据直接推断日龄，进而应用于PMI推断；2)间接推断法，或称为有效积温法，即将现场采集幼虫带回实验室在一定的温、湿度条件下饲养、观察，直至下一虫态，再应用有效积温法则，间接推断蝇类的日龄以应用于PMI推断。虽然近年来上述方法用于PMI推断的可行性已被理论和案例所证明，但存在人为设定指标及主观性较强等弊端，以及外界环境因素的干扰等，使其客观性、准确性及可重复性受到质疑，因此现有发育阶段判断体系并不能让其在法庭科学中发挥出应有的价值。

近年来随着分子生物学技术的发展，大量实验研究已经证实基因差异表达用于昆虫日龄推断的科学性及可行性。2002年Science首次公开证实，不同日龄的黑腹果蝇基因表达具有差异性，提示差异基因表达可应用于蝇类的日龄推断。2007年有研究者将在黑腹果蝇中发现的与卵发育相关的3种基因(bcd，sll， cs)应用到丝光绿蝇，发现这三种基因的表达水平与卵的发育时间呈线性关系，甚至可以精确到2小时内。随后2011年再次证实多个差异基因的表达与丝光绿蝇幼虫及蛹的发育存在时序性变化关系。但考虑到物种之间基因功能的异质性，将果蝇这种模式物种被发现的基因功能单纯拷贝到其他物种中进行验证，显然缺乏一定的科学性、严谨性和准确性。

随着高通量测序技术的兴起，在分子生物学中联合多基因组学研究某些表达因子的具体功能机制已成为热点。2018年基于RNA-seq测序对桔小实蝇 (Bactroceradorsalis)从离食期至化蛹的不同发育阶段差异基因功能富集分析，编码氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和保幼激素(juvenile hormone (JH))通路的相关基因显著下调，蜕皮激素(20-hydroxyecdysone)和几丁质消化酶(chitinolytic enzymes)通路相关基因显著上调。2015年Zajac等对红头丽蝇15个不同蛹期样本进行de novo转录组测序分析，首次建立了红头丽蝇蛹期不同发育阶段生物分子标记数据库，同时也为差异表达基因在法医昆虫不同发育阶段推断应用奠定基础。因此，差异表达基因具有应用于不同发育历期发育时间推算的潜在价值。

差异基因表达的结果客观性强，弱化了人为主观臆断因素，在法庭上更容易被接受，同时也能进行误差计算，更符合杜伯特法则的需求。但现有的研究对差异基因的筛选较为盲目，并没有真正明确该基因在在其生长发育中的具体功能，缺乏针对嗜尸性蝇类自身特点的相关差异基因研究。