[发明专利]一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法

说明书

本发明属于细菌检测技术领域，具体公开了一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。所述方法是将菌液利用微流控技术，形成微液滴。将生成的微滴培养后拍照，再通过人工计数或借助计算机技术等，将其计数，得到特殊状态菌的数量。同时，可对特殊状态菌进行分选和富集。相比较于现有的平板法计数，或只对膜完整的活菌进行计数，本发明准确性大大提升，突破了现有的对特殊状态菌的计数方式，能够及时有效地判断食品卫生状况，是消除食源性致病菌隐性残留造成食源性疾病的有效手段。同时，本发明方法能够对特殊状态菌进行富集和分选，降低研究过程中细胞异质性带来的结果误差，对研究细胞变化机制和研究菌的生长活动有较大的价值。

技术领域

本发明属于细菌检测技术领域，更具体地，涉及一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。

背景技术

细菌的特殊状态是细菌在受到外界环境影响时，细菌为了生存而产生的一种反应。如细菌“活的非可培养”状态（viable but non- culturable state,VBNC）以及在抗生素作用下产生的耐药菌。

VBNC状态是细菌在受到外界不良环境的胁迫时，通过调整自身的代谢途径，进入的一种自我保护状态。在这个过程中，细菌的形态逐渐发生改变并且不能够在平板上生长繁殖，因此，常规的平板检测法不能检测到VBNC状态的细菌。但是，当外界的环境变得适宜时，VBNC状态的细菌可能会进行复苏，恢复可培养的能力。对于一些致病菌来说，VBNC状态下的致病菌通常不具备致病性，但致病菌的致病性能够随着VBNC状态的复苏而恢复，仍然会引起人类疾病。因此，能够准确识别VBNC的存在利于及时有效地判断食品卫生状况，是消除食源性致病菌隐性残留造成食源性疾病的有效手段，从而防止食品安全问题的发生。同时，对于加强我全省对该特殊状态食源致病菌的快速识别能力，提高市场监管及进出口商品检验的效率，提高企业的产品质量监控水平，降低企业经营风险具有重大意义。

VBNC状态的致病菌的计数，常用DNA修饰染料如叠氮溴化丙锭（PMA）和分子检测方法如荧光定量PCR（qPCR）以及荧光环介导等温DNA扩增相结合的方法，当可培养数降为0，而活菌数不为0时，认为此时的活菌处于VBNC状态。但采用DNA修饰染料结合分子检测方法只能评估膜完整的活菌数量，无法直观准确区分活菌样本中的其他表型如VBNC表型。除此之外，上述方法依赖平板检测法测定值的准确程度，属于相对定量的检测方法，并不能准确定量。

耐药菌是抗菌药物与细菌长期、广泛对峙的结果，或者说是细菌在药物的压迫或刺激下，为了生存而产生的一种反应。当耐药菌定值到人体中时，抗菌药物的滥用会杀死敏感细菌而使得耐药菌处于优势，并在绝对优势下进一步生长繁殖，从而引发严重感染。

目前，无论是对于特殊状态如VBNC状态菌的计数，还是对耐药菌形成机理的研究，都是基于群体层面。对于VBNC状态菌的计数，建立在平板培养法以及膜完整原则之上，造成结果误差较大。对于耐药菌来说，在研究其形成机制时，因为无法准确区分不同状态菌而将其混在一起进行研究。但是，不同状态菌会在细胞水平和分子水平上存在明显的细胞间异质性，结果只能给出多种特殊状态形成结果的一个平均值，无法针对某种状态形成原因进行准确的了解其形成机制，更无法具有针对性的进行防控。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中不能精准定量特殊状态菌的数量的问题，提供了一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法。

通过该发明方法，能够从单细胞角度观察每个细菌在受到外界环境胁迫时的状态变化，并通过人工计数或借助计算机算法准确计数细菌不同表型的数量。

同时，通过精准定量，进一步能够实现精准的分选和富集。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种基于微流控可视化技术精确测定特殊状态菌及其分选富集的方法，将菌液利用微流控技术，形成微液滴，然后将菌液培养后进行计数。