[发明专利]一种检测大肠埃希菌的方法及试剂盒

说明书

本说明书实施例涉及一种检测大肠埃希菌的方法及试剂盒，该检测方案中，基于大肠埃希菌中16SrRNA的同源序列设计并合成上游引物16F19和下游引物16R1514，以及，基于大肠埃希菌K‑12 MG1655乳糖操纵子LacI基因的同源序列设计并合成上游引物LF20和下游引物LR1039，并基于引物组合构建双重PCR反应体系进行扩增鉴定。使用双重PCR检测，既保证特异性，又操作简单，避免复杂因素影响；使用16SrDNA作为控制指标，确保大肠埃希菌属不漏检，LacI基因为大肠埃希菌特有基因，可以控制假阳性。从而，提升检测灵敏度和特异性，同时，检测实现简单，快速，成本低，易推广。

技术领域

本说明书实施例涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测大肠埃希菌的方法及试剂盒。

背景技术

大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)又称大肠杆菌，是粪便污染指示菌之一。在大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希菌三种粪便污染指示菌中，大肠埃希菌检出的意义最大。所以，大肠埃希菌在样品检验中是经常被检验的指标。在水体中大肠埃希菌的数量反映水体被人畜粪便污染的情况。我国生活饮用水大肠埃希菌限量标准为不得检出(GB5479—2006)。《中华人民共和国国家标准》发布的生活饮用水中大肠埃希菌检测的方法有三种(以下简称国标法)，分别为：多管发酵法、滤膜法和酶底物法(GB/T5750.12-2006)。三种方法均是利用大肠埃希菌特有的生化反应进行鉴定，所以三种方法均需要细菌培养步骤，其中多管发酵法培养时间为48小时，滤膜法为28小时，酶底物法为24小时。

自从1985年美国化学家Kary Mullis发明了PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术以来，该技术便被广泛应用于微生物检验领域。PCR技术的原理是以特定的DNA链为目标，利用人工合成的该DNA链的上下游引物和DNA聚合酶，通过数十次的变性、退火和延伸循环，在体外实现目标DNA的扩增。扩增产物的鉴定可以利用琼脂糖凝胶电泳、寡核苷酸探针、DNA芯片、免疫技术或者其他的发光技术等。不同于国标法，PCR技术不需要微生物的培养步骤，通过鉴定特定DNA片段的有无来间接反映待检微生物的有无。而且该技术具有灵敏性高、特异性好，省时、易操作等特点。

随着PCR技术的广泛应用，许多延伸技术也不断被开发出来，比如：(一)多重PCR技术，也称之为复合PCR(Multiplex PCR)，即一个反应体系中加入两对以上不同的引物同时扩增，这两对引物可以是不同来源的不同基因，也可以是同一来源的不同基因；(二)巢式PCR(Nesting PCR)，利用内外两套引物先后扩增靶基因；(三)实时荧光定量PCR(real-timeflurescent quantitive PCR)，利用荧光信号强度与DNA浓度成正比的原理，借助相应的仪器进行定量检测的PCR技术；(四)免疫-PCR，是将抗原-抗体免疫反应同PCR结合的技术；(五)rep-PCR，(重复序列引物聚合酶链反应)，是在随机扩增DNA多态性(RAPD)分析基础上发展的对细菌进行指纹图谱分析的一种新方法，可用于细菌的分型；(六)环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30－60分钟，即可完成核酸扩增反应。