[发明专利]一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包

权利要求书

1.一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，并包括以下步骤：

（1）针对ABO基因序列的特异性，设计并合成长片段PCR扩增引物；

（2）制备人基因组DNA；

（3）分两组PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子区域序列；

（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行磁珠法纯化；

（5）通过Qubit DNA双链定量测定试剂将步骤（4）得到的两组纯化产物进行准确定量分析，并将两组纯化产物进行等摩尔混合；

（6）将步骤（5）得到的等摩尔混合产物进行文库制备，包括扩增产物采用转座子酶法片段化、片段化产物磁珠法纯化、Index序列扩增和文库扩增后片段选择；

（7）将步骤（6）获得的文库通过Aligent 4200电泳仪进行质量检测，分析文库的片段大小，并通过Qubit DNA双链定量测定试剂准确定量后进行文库混合；

（8）采用Illumina测序试剂，将步骤（7）获得的混合文库进行Illumina Miseq平台测序上机；

（9）将步骤（8）得到的FASTQ原始数据，采用CLC Main Workbench 12.0 software专用软件进行生物信息学分析，指定个体ABO基因型。

2.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中两组PCR反应体系包括：

第1组扩增ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子的反应体系：5×GLXPCR 缓冲液5.0 μl；2.5 mM dNTP 2.0 μl；引物浓度25 µM，ABO1 longF和ABO1 longR各0.2µl；1.25U/µl GLX-Taq酶0.5 µl；50-100 ng/µl DNA 4.0 µl；以H₂O 13.1 µl补足至25 µl，其中：ABO1 longF的序列为GCTTCCAGCTTTTGGCTATG，ABO1 longR的序列为GTGACCACGGAGCGATTTAT；

第2组扩增ABO基因第1号内含子至第7号外显子的反应体系：5×GLX PCR 缓冲液5.0μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；引物浓度25 µM，ABOe27longF和ABOe27longR各0.2 µl；1.25U/µlGLX-Taq酶0.5 µl；50-100 ng/µl DNA 4.0 µl；以H₂O 13.1 µl补足至25 µl；其中：ABOe27longF的序列为GGATTAACAATGGCGTGCTT，ABOe27longR的序列为GGACGGACAAAGGAAACAGA。

3.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中两组PCR反应程序均为：

94℃ 预变性1 min，98℃ 变性10 s，68℃退火加延伸10 min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。

4.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（4）中磁珠法纯化所需的磁珠为Agencourt® AMPure® XP磁珠。

5.根据权利要求1所述的基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述步骤（5）中Qubit DNA双链定量试剂为Qubit dsDNA 高灵敏分析试剂。