[发明专利]NK细胞扩增方法

说明书

本发明提供一种高效的NK细胞扩增方法，该扩增方法包括以下步骤：(1)分离获得单个核细胞；(2)加入无血清培养基和活化因子，培养；其中，活化因子为IL‑2和CD3单抗。本发明实施例所提供的NK细胞扩增方法在单个核细胞分离出来后直接进行体外扩增，选用特定的活化因子的组合，从而实现极为高效的NK细胞扩增，扩增倍数可达到3000倍以上，相比于现有的扩增方法提升了一个数量级，具有非常好的扩增效果，操作简单。

技术领域

本发明涉及NK细胞培养技术领域，尤其是涉及一种NK细胞扩增方法。

背景技术

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是无T和B细胞特征表面特征的第三类淋巴细胞中最主要的一种，是连接先天性和特异性免疫系统的桥梁。正常情况下，机体内NK细胞大多在外周血中循环，并以未活化状态存在。NK细胞可在未经致敏情况下，快速杀灭恶变细胞和病毒感染细胞，展现出特殊的免疫调节功能和细胞毒功能。但是NK细胞在体内外周血液中所占比例很少，一般不超过淋巴细胞总数的10％，在短期内要获得大量高纯度的NK细胞比较困难。

为此，研究人员尝试通过体外扩增的方式获得NK细胞。其中最常用的是通过饲养细胞的方法来培养外周血单个核细胞中的NK细胞，这种方法虽然能够获得大量的NK细胞，但人源细胞的引入可能会带来一定的安全隐患。另有一些使用的比较广泛的方法，例如通过细胞因子来刺激NK细胞的扩增。但现有的细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法所提升的扩增倍数较小，一般在一两百倍左右，难以满足临床上对NK细胞的需求。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种高效的NK细胞扩增方法。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种NK细胞扩增方法，该扩增方法包括以下步骤：

(1)分离获得单个核细胞；

(2)加入无血清培养基和活化因子，培养；

其中，活化因子为IL-2(白细胞介素-2)和CD3单抗。

本发明实施例的NK细胞扩增方法至少具有如下有益效果：

本方案在单个核细胞分离出来后直接进行体外扩增，选用特定的活化因子的组合，实现了极为高效的NK细胞扩增，扩增倍数可达到3000倍以上，相比于现有的扩增方法提升了一个数量级，具有非常好的扩增效果，同时操作简单、成本低廉。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，IL-2的终浓度为300～800IU/mL，CD3单抗的终浓度为4～20ng/mL。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，基于无血清培养基的总体积，单个核细胞的细胞密度为0.5×10⁶～1.0×10⁶/mL。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，培养第5天全换液。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液后，培养基内IL-2的终浓度为300～800IU/mL。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液包括以下步骤：

在第5天离心、去上清后，加入缓冲液混匀，离心，保留沉淀；

将沉淀重悬于无血清培养基，继续培养。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，全换液后，每隔1～2天补加无血清培养基和终浓度为300～800IU/ml的IL-2。

根据本发明的一些实施例的NK细胞扩增方法，无血清培养基中包括1～5％体积比的自体血浆。由于现有的培养基中基本添加了人血清白蛋白，通过额外添加1～5％的自体血浆可以增加NK细胞的扩增倍数。