[发明专利]烟草叶片和原生质体的线粒体荧光标记方法

权利要求书

1.一种烟草叶片和原生质体的线粒体荧光标记的方法，包括以下步骤：

步骤一、配制含有Mitotracker Red CMXRos染料的工作液；

步骤二、分离烟草叶片和原生质体，将烟草叶片和原生质体在含有Mitotracker RedCMXRos染料的工作液中染色；

其中，烟草原生质体的分离方法为：

(1)选取生长状态良好的烟草叶片切成细丝，放在酶解液中解离；

(2)在酶解液中解离完成之后加入等体积的W5溶液稀释酶解液，用200目的筛子过滤，滤液收集在圆底离心管中；

(3)离心收集原生质体，弃掉上清，用W5溶液清洗沉淀一次；

(4)将原生质体重悬于MMG溶液；

步骤三、采用缓冲液对已染色的烟草叶片和原生质体进行清洗；

步骤四、采用激光共聚焦显微镜对经过步骤三种清洗好的烟草叶片和原生质体观察拍照，其中激发波长为559nm，发射波长为600-630nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤一中，Mitotracker Red CMXRos染料的工作液的配制方法为：将Mitotracker Red CMXRos染料用ddH2O稀释成500nM的工作液浓度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中的烟草叶片染色前用剪刀把烟草叶片剪成1cm²的小块。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中，在酶解液中解离2个小时，期间每隔半个小时镜检一下原生质体的状态。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤二中，分离烟草原生质体的所述酶解液配方为：纤维素酶1.5％(m/v)，离析酶0.4％(m/v),β-巯基乙醇0.05％(v/v)，0.2％BSA(m/v)，0.4M甘露醇，0.02M MES,10mM CaCl₂·2H₂O，PH＝5.7左右；W5溶液的配方为0.4M甘露醇，2mM KCl，20mM MES,PH＝5.7左右；MMG溶液的配方为0.4M甘露醇，15mM MgCl2，4mMMES,PH＝5.7左右。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤二的烟草叶片的染色温度为20-25℃，染色时间为10-12h，染料工作液浓度为500nM，烟草原生质体的染色温度为37度，染色时间为20-30min，染料工作液浓度为500nM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三中，清洗烟草叶片的缓冲液是ddH₂O，清洗烟草原生质体的缓冲液是MMG溶液。