[发明专利]一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于DPP‑4活性检测的质谱探针及其应用。该质谱探针包括氨基酸序列为Glu‑Pro‑Phe‑Lys的多肽及修饰在所述多肽的谷氨酸的哌嗪类化合物。本发明提供的质谱探针由可被DPP‑4特异性识别的多肽Glu‑Pro‑Phe‑Lys与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被DPP‑4特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应DPP‑4的活性，适用于血清等复杂体系中酶活性的检测，也适用于从中药等复杂体系中筛选具有DPP‑4抑制活性的化合物。

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种用于DPP-4活性检测的质谱探针及其制备方法和应用。

背景技术

肠促胰岛素(incretin)是一类在肠道生成的具有促胰岛素分泌作用的多肽类激素，它不仅能刺激胰岛素分泌，还有抑制餐后胰高血糖素分泌、延缓肠排空、抑制食欲、增强胰岛素敏感性等作用。肠促胰岛素包括了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)，二者对促进胰岛素释放及胰腺外调节胰岛素水平显示出诸多优点。然而GLP-1和GIP在体内很快被DPP-4水解，且水解产物影响其生理功能的发挥，使得二者无法在临床上得到很好的应用。

DPP-4是一种丝氨酸肽酶，可特异性识别肠促胰岛素N端第二位的脯氨酸(proline)或丙氨酸(alanine)，并切断N端2个氨基酸，使肠促胰岛素失活，从而影响肠促胰岛素的生理作用，进而影响糖尿病的发生发展。研究表明，DPP-4活性与糖尿病的发生发展有着密切关系，DPP-4抑制剂可降低DPP-4的催化活性，抑制肠促胰岛素水解，从而提升肠促胰岛素的浓度，取得改善血糖、保护β细胞功能的效果。

目前常用的DPP-4抑制剂筛选方法有以甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4甲基香豆素为底物的荧光底物法和以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺为底物的发色底物法。由于这些方法对反应时间、样品处理要求较高，需反复验证或通过其它方法相互验证，难以直接测定得到DPP-4活性。

针对上述问题，本发明人在申请号为CN201510507259.X的专利文献公开了一种用于DPP-4检测的多肽及包含该多肽的荧光探针。该荧光探针由特异性识别DPP-4的多肽与聚集诱导发光分子连接而成，多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(EPKF)，聚集诱导发光分子与多肽中的赖氨酸相连。由于多肽N端第二位含有脯氨酸，使得该荧光探针中的多肽能被DPP-4特异性识别，切断该多肽；由此可知，该荧光探针本身基本无荧光吸收，但当其失去N端二肽时，则会产生明显的荧光吸收，从而能对DPP-4活性进行特异性的实时检测。

在蛋白质分析中，为了提高检测的灵敏度和专属性，同时扩宽检测范围，常会对蛋白质样品进行预处理。肽段化学衍生就是蛋白质分析中常用的一种样品预处理方法，通过对肽段的氨基、巯基或羧基进行衍生化处理，引入易电离的小分子标签，从而达到提高检测灵敏度的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被DPP-4特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测DPP-4的活性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于DPP-4活性检测的质谱探针，包括：氨基酸序列为Glu-Pro-Phe-Lys的多肽及修饰在所述多肽的谷氨酸上的哌嗪类化合物。

本发明的质谱探针由可被DPP-4特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：谷氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(SEQ ID NO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链上的谷氨酸的羧基缩合。

DPP-4酶切位点为脯氨酸与苯丙氨酸之间的酰胺键，因此，本发明质谱探针的酶切产物为哌嗪类化合物-谷氨酸-脯氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物的量，即可检测DPP-4的活性。