[发明专利]一种疫苗菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）待筛选菌株分离培养：从疑似病理组织中获取含菌病料，进行分离培养，得到待筛选菌株；

（2）鉴定待筛选菌株是否为所需种类的疫苗菌株，如果是，则进行后续操作；

（3）鉴定待筛选菌株的血清型；

（4）获取待筛选菌株的基因指纹；

（5）混合菌株感染模型的建立: 从步骤（1）所得待筛选菌株中挑取单菌落，进行培养后调整菌株浓度，选取相同血清型的不同待筛选菌株进行多个菌株同样的浓度混合，每个组内多个菌株的浓度一样，按照不同细菌浓度得到多个混合组；且同混合组内待筛选菌株的基因指纹不同；然后进行攻毒，在攻毒后不同时间梯度分离菌株，以获得最佳攻毒剂量以及攻毒后最佳分离待筛选菌株的时间；

（6）从步骤（1）所得待筛选菌株中重新挑取单菌落，按照步骤（5）建立多个混合组，并筛选出每个混合组中的1~3个优胜者；

（7）重复步骤（6）从而获得多个优胜者，测序各个优胜者的基因指纹，然后再将多个优胜者组成新的小组，按照步骤（6)的方式继续筛选，得到多个最佳优胜者；

(8) 将最佳优胜者中的各菌株按照相同的剂量制备灭活苗，进行免疫和交叉保护试验，保护效果最佳的菌株即为所需的疫苗菌株；

所述步骤（4）中，获取待筛选菌株的基因指纹的方法包括以下步骤：

（4a）基因组提取：从步骤（1）所得待筛选菌株中挑取单菌落，培养后提取基因组；

（4b）采用PCR扩增步骤（4a）所得基因组的高变异片段，通过电泳检测PCR扩增产物，并进行胶回收；

（4c）进行测序分析，然后对比测序结果，得到待筛选菌株的基因指纹；

所述疫苗菌株为鸭疫里默氏杆菌，所述步骤（4b）中的高变异片段为CRISPR spacer序列；

所述步骤（4b）中，PCR扩增的试剂包括如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的引物。

2.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（7）中，最佳优胜者为3-5株待筛选菌株。

3.如权利要求1~2任一项所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述疫苗菌株用于鸭。

4.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中，疑似病理组织为肝脏或鸭脑。

5.如权利要求1所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤（4b）中，PCR扩增的试剂还包括2×Taq PCR Mix、双蒸水、阴性对照品和阳性对照品。

6.如权利要求5所述的疫苗菌株的筛选方法，其特征在于，所述阴性对照品为双蒸水，所述阳性对照品为鸭疫里默氏杆菌基因组。