[发明专利]一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。本发明首先公开了重组大肠杆菌，其与受体大肠杆菌相比，蛋白质A的基因的表达量和/或含量和/或活性，和/或蛋白质B的基因的表达量降低和/或含量和/或活性；所述蛋白质A为如下至少一种：苹果酸硫激酶；苹果酰辅酶A裂解酶；乙醛酸还原酶；异柠檬酸裂解酶；异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶；所述蛋白质B为如下至少一种：NAD依赖型‑苹果酸酶；NADP依赖型‑苹果酸酶；苹果酸合酶A；乙醛酸途径转录抑制因子；乙醇酸氧化酶。进一步提供了制备乙醇酸的方法。本发明以葡萄糖为原料进行利用构建的重组大肠杆菌使葡萄糖具有更高的转化率，大大提高了乙醇酸的产量。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

乙醇酸(英文名为Glycolic acid)又名羟基乙酸，是最简单的α-羟基酸,被广泛用于工业加工、化妆品行业和聚合物(PGA、PLGA)的合成。高纯度的乙醇酸价格在30000-40000元/吨。

目前，乙醇酸的合成主要有化学合成法和生物合成法。化学合成主要有氯乙酸法、甲醛羰基化法、氰化法、酯交换法等等，但是化学反应存在反应条件严苛、催化剂难以回收利用以及污染环境等缺点。生物合成法又可以细分为生物酶法合成和全生物合成，生物酶法主要利用的酶有产腈水解酶和产甘油氧化酶，分别水解乙醇腈和氧化乙二醇获得乙醇酸。由于生物酶法所需要的前体物质比较昂贵并且该前体物质本身或其降解产物有毒害作用，所以目前该方法并没有得到广泛的应用。为了解决上述问题，研究者试图以微生物为细胞工厂，以葡萄糖、木糖、乙醇、乙烯乙二醇等化合物作为碳源来生产乙醇酸。目前以葡萄糖为碳源，在大肠杆菌中利用乙醛酸途径最高能得到56.44g/L乙醇酸；以D-木糖和乙醇为碳源，在酵母工程菌中能得到15g/L乙醇酸；以乙烯乙二醇为碳源，利用毕赤酵母和红酵母能分别得到105g/L和110g/L的乙醇酸。除此之外，谷氨酸棒状杆菌、化能自养型铁硫细菌以及伯克霍尔德菌也被报道能用于乙醇酸的生产。

生物法合成乙醇酸的主要技术限制仍然是所采用途径的理论转化率低，因此一条新的高转化率路线亟待开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供高产的乙醇酸菌株，以实现乙醇酸的高效合成。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组大肠杆菌。

本发明重组大肠杆菌与受体大肠杆菌相比，所述重组大肠杆菌中蛋白质A的基因的表达量增加和/或所述蛋白质A的含量增加和/或所述蛋白质A的活性增加，和/或所述重组大肠杆菌中蛋白质B的基因的表达量降低和/或所述蛋白质B的含量降低和/或所述蛋白质B的活性降低；

所述蛋白质A选自如下至少一种：

A1)苹果酸硫激酶；

A2)苹果酰辅酶A裂解酶；

A3)乙醛酸还原酶；

A4)异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶；

A5)异柠檬酸裂解酶；

所述蛋白质B选自如下至少一种：

B1)NAD依赖型-苹果酸酶；

B2)NADP依赖型-苹果酸酶；

B3)苹果酸合酶A；

B4)乙醛酸途径转录抑制因子；

B5)乙醇酸氧化酶。

上述重组大肠杆菌中，所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌K12，更具体的为大肠杆菌BW25113。