[发明专利]一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用

说明书

本发明公开了一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用，属于生物化工领域。本发明通过大肠杆菌重组质粒外源表达获得带有His‑tag的包涵体N‑Lg‑Flo1p，通过变性溶解及复性，经Ni‑NTA琼脂糖凝胶6FF纯化后，制得一种结合了N‑Lg‑Flo1p的新型亲和吸附剂，经检测其吸附甘露低聚糖的能力达到10.14mg/mL，为甘露低聚糖特异性吸附剂的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种以酵母絮凝蛋白为配基的亲和吸附剂及应用，属于生物化工领域。

背景技术

酵母絮凝蛋白(Lg-Flo1p)是由酵母菌基因组中典型的含基因内重复序列的基因(统称为FLO基因家族)编码，由N端、C端和中间重复序列三个结构域组成的细胞壁蛋白，这些蛋白的C端以共价键连接到细胞壁上，暴露的N端则可与相邻酵母细胞壁的甘露糖残基特异性结合导致絮凝。

甘露低聚糖不被人体胃肠道消化，可以促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的特异性增殖并抑制有害菌的生长，减少有毒代谢产物的生成，改善人体肠道功能的作用，防止便秘，保护肝脏，抗肿瘤及增强免疫力，可用作食品或饲料添加剂。甘露低聚糖具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代的功能性食品。

目前，甘露低聚糖的生产方法主要包括从天然原料中提取、化学降解及生物降解。前两种方法的后期处理较为复杂，成本高，并且借助酸碱水解的化学法对环境的污染较大。生物降解的过程无毒且安全，反应条件温和。甘露低聚糖主要采用内切甘露聚糖酶水解甘露聚糖获得，但副反应较多，分离纯化有一定的困难，因此开发一种特异性吸附剂，将甘露聚糖酶解后的产物进行特异性分离，对单一甘露低聚糖的制备具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种以酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)为配基的新型亲和吸附剂，用于甘露低聚糖等功能性糖类物质的分离纯化。

本发明的第一个目的是提供一种亲和吸附剂，所述吸附剂是以酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)为配基，与琼脂糖凝胶结合得到的。

在一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶为Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF或CNBr活化的琼脂糖凝胶4B。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母絮凝蛋白(N-Lg-Flo1p)携带6×组氨酸标签。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p是从重组大肠杆菌中表达得到的。

在本发明的一种实施方式中，编码所述酵母絮凝蛋白N-Lg-Flo1p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种以N-Lg-Flo1p为配基的亲和吸附剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将含有Lg-Flo1p的N端基因序列的重组质粒在大肠杆菌中进行表达，获得外源包涵体N-Lg-Flo1p，并对其进行变性溶解及复性；

(2)吸取Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF 1mL装柱子，用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl、0.2mMNaCl)平衡10个柱体积；

(3)将N-Lg-Flo1p复性液(已测定蛋白含量)加入到吸附柱中纯化，用5倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，收集洗涤液，直到没有蛋白流出，获得。

本发明的第三个目的是提供一种采用上述亲和吸附剂吸附甘露低聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)将结合了N-Lg-Flo1p的Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF 1mL，加入到含有甘露低聚糖的溶液中，在转速为80～100r/min振荡0.5～1.5h；

(2)将吸附剂装柱，用含有0.2M NaCl、pH4.5的20mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集甘露低聚糖。