[发明专利]创伤弧菌的核酸快速恒温检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种针对创伤弧菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒。所述方法为：从待测样品中提取基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，以能扩增创伤弧菌特异性序列的引物组为引物，在酶反应体系下进行恒温扩增反应；通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在创伤弧菌。本发明检测方法具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低，具广泛应用前景。

本申请是2016年8月30日提交的、申请号为201610767402.3、发明名称为：“快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒和应用”的中国发明专利申请的分案申请；该母案申请要求申请日为2015年9月2日、申请号为201510556917.4、发明名称为“快速恒温检测阪崎克罗诺杆菌的方法、引物及试剂盒”的中国发明专利申请的优先权。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测创伤弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，又称海洋弧菌，是在海水和一些海洋食品中发现的一种嗜盐性革兰氏阴性致病菌。人类通常是因为生食受污染的海产品，或者伤口接触受污染的海水或海洋动物而感染该细菌，可引起原发性败血症、创伤感染和急性胃肠炎等症状，其中引起的败血症性休克的死亡率高达50％以上。在我国，创伤弧菌感染多发生于沿海地区，被列为食品污染源中八大高危微生物之一。此外，由创伤弧菌引起的最初症状并无明显特异性，因此对该菌的预防和检测尤为重要。

目前，针对创伤弧菌的检测主要通过病原分离与生化鉴定完成，但存在检测周期长，操作繁琐，不易鉴别相近物种等缺点。近年来随着核酸分子检测技术的发展，以特异性基因为靶标建立的常规PCR或real-time PCR技术已成功应用于创伤弧菌的实验室诊断，具有灵敏度高，检测时间短等优点，但该方法必须配备昂贵的仪器设备，需专门的操作人员。因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的创伤弧菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。