[发明专利]一种纯化重组蛋白的方法

说明书

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种纯化重组蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将含有目的重组蛋白的发酵液，通过至少一个切向流膜过滤步骤进行澄清、浓缩处理，然后进行疏水层析、反相层析、除热原、超滤和装瓶，获得纯度99.5％的重组白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白，该方法适合于规模化工业生产重组白细胞抑制因子和水蛭素嵌合蛋白。

技术领域

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种纯化重组蛋白的方法。

背景技术

重组蛋白类药物通常采用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等进行表达，其中结合基因工程大规模培养生产蛋白质药物已成为当今生物制药领域的主流。临床许多蛋白类药物需用较高剂量或长期用药，市场需求量大，因此该类生物制药的大规模生产对工艺质量要求较高，必须符合严格的制药标准。抗体类或者Fc融合蛋白类药物通常采用一步ProteinA亲和层析即可达到90％以上纯度，其他污染性杂质如脱落的Protein A、宿主细胞蛋白(HCP)、聚集体(D/A)以及DNA等主要通过离子交换等层析方法去除；其他重组蛋白药物的HCP、聚集体及DNA等杂质则往往需要更多的纯化步骤进行去除。

目前，重组蛋白的分离纯化主要有以下几种方法：a)一步法，包括一步凝胶筛分法、一步镍离子螯合层析法、一步亲和层析等；b)两步法，包括亲和层析—阴离子交换层析、亲和层析-阳离子交换层析、阴离子交换层析-分子筛层析、阴离子交换层析-镍离子螯合层析法、反向层析-镍离子螯合层析法、疏水层析-羟基磷灰石柱层析、疏水层析—阳离子交换层析、阴离子交换层析-阳离子交换层析等；c)多步法，包括羟基磷灰石柱层析-羟基磷灰石柱层析-反向层析、热处理-离子交换-乙醇沉淀法，热处理-活性炭吸附-二次活性炭吸附，疏水层析-离子交换层析-分子筛层析，阴离子交换层析-疏水层析-羟基磷灰石柱层析-阳离子交换层析，阴离子层析柱-氨基苯硼酸柱层析或苯基交联琼脂糖凝胶层析柱-陶瓷羟基磷灰石层析柱-阳离子层析柱等。

发明CN105418768A公开了一种重组嵌合蛋白的制备方法和用途，使用镍离子螯合层析纯化获得重组蛋白，该方法涉及蛋白反复复性操作，影响蛋白活性；且梯度洗脱中使用大量含氮杂环化合物的洗脱液、工艺繁琐。

早在1972年，Hjelm等人就提出采用IgG亲和层析的方法纯化重组蛋白：以交联琼脂糖凝胶为载体，采用溴化氰活化工艺，以IgG为功能基制成亲和层析柱纯化重组蛋白。该方法操作简单，且一步层析操作即可使纯化的重组蛋白纯度达到95％。然而，由于IgG属生物大分子，分子量大(Mr＝150000)，因此为减少空间位阻，单位体积载体上只能偶联少量的IgG，造成亲和层析柱动态载量低，难以大规模生产，多用于实验室规模纯化；且偶联IgG时利用的是IgG表面大量的氨基，属于多点偶联工艺，必然导致固定化的蛋白空间取向不均一，增大了空间位阻。

发明US 5075423A使用亲和层析—阴离子交换层析纯化重组蛋白，仍存在亲和层析载量低、空间位阻大的劣势。CN101220082B公开了一种重组蛋白提取纯化方法，使用离子交换-分子筛层析，该方法涉及反复变性、复性，影响重组蛋白活性。发明CN103695508B公开了金黄色葡萄球菌HI重组蛋白的发酵和纯化工艺，纯化工艺使用亲和层析-阳离子交换层析，洗脱使用自动上样洗脱，洗脱剂种类多、操作复杂。发明CN109055416A公开了一种可溶性重组蛋白的制备方法，纯化使用亲和层析-亲和层析，虽避免包涵体蛋白后处理复性及活性不稳定的问题，但仍涉及酶切，且洗脱中使用大量含氮杂环化合物的洗脱液，可操作性不强。发明WO 2007/035341A1，公开了一种纯化蛋白的方法，使用过滤、渗滤、以及两步连续的层析操作，其中第一步为阴离子交换层析、疏水作用层析或陶瓷羟基磷灰石层析，第二步为阳离子交换层析，该方法同样存在操作步骤多、效率低问题。发明CN103145813A公开了一种分离纯化重组蛋白A的方法，使用加热、两次活性炭吸附和疏水层析纯化蛋白，仍未避免使用含表面活性剂的缓冲液，且表面活性剂的使用量直接影响蛋白回收率；存在活性炭吸附蛋白的可能；使用加热煮沸处理影响蛋白的活性，蛋白质总回收率为53％。