[发明专利]一种生产抗CD47抗体的培养基及发酵方法

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种生产抗CD47抗体的培养基及其发酵方法，本发明基础培养基中包含氨基酸、葡萄糖、维生素、微量元素、无机盐和其他物质；发酵过程中适时进行补料培养，补料培养基包括氨基酸组分。本发明将自主优化的培养基代替商业化的培养基，更好地促进细胞生长，有效提高了抗CD47抗体的表达量。并在发酵过程中调整补料工艺，有效降低了蛋白酸碱峰含量，提高了目的蛋白纯度。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种生产抗CD47抗体的培养基及发酵方法。

背景技术

单克隆抗体具有高特异性、低副作用、效果优异的特点，在治疗和诊断中应用越来越广泛。分化簇蛋白47(CD47)也称为整合素相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3和Rh-相关的抗原，是一种广泛表达在细胞膜表面的五次跨膜蛋白(pentaspan transmembrane)超家族成员。CD47与巨噬细胞上的SIRP-α(信号调节蛋白-α)相互作用，从而抑制吞噬作用。该途径的癌细胞逃避吞噬作用并由此促进癌细胞存活(Jaiswal，S.等人，Trends in Immunol31:212-219,2010)，这是最新发现的肿瘤免疫逃逸机制，因此治疗学上靶向CD47已广泛应用于多种癌症。

CD47广泛的表达于细胞的表面，可与SIRPα、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。TSP1与细胞的增殖，生长和分化有关，CD47与TSP1的结合在调节细胞迁移，细胞增殖和凋亡以及促进血管生成和炎症反应中发挥重要作用。此外CD47是细胞表面一个重要的自我识别标记。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。

不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。

目前已有报道了多个抗CD47抗体，美国专利US2015/0183874A报道了衍生自B6H12的人IgG1型嵌合单克隆抗体和通过CDR移植产生的人源化B6H12抗体，其相比较于已知抗体具有更低的免疫原性。美国专利US9045541报道了不显著引起血凝反应的抗CD47抗体，并且该抗体与已知抗体相比，在肿瘤模型中显著有效，例如提高巨噬细胞的吞噬肿瘤细胞的能力。

现有技术中对抗CD47抗体的生产方法报道较少。CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamster Overy)是生产单克隆抗体蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞，有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的。相对于其他细胞表达系统，CHO细胞具有与人相似的翻译后修饰、历史背景清晰、细胞稳健、生长迅速等优势。

然而由于单克隆抗体具有复杂的大分子结构，在生产和储存过程中会产生大量修饰。比如糖基化、氧化、脱酰胺等，使得抗体产生大量的异质性，也被称为电荷异构体。采用CEX-HPLC或CIEF方法进行分析会得到一系列的峰，主要分为三类：酸性峰、主峰、碱性峰。电荷异构体对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其称为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异构体产生酸碱峰，碱性峰主要来源于C末端赖氨酸去除不完全、N末端焦谷氨酰胺环化胺等。酸性峰一般来源于N-糖末的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。但此酸性峰和碱性峰对应的电荷异构体具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的难度，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的挑战性，成为本领域一直难以解决的问题。