[发明专利]一种荧光纳米传感器标记的拟胚体的制备方法及毒性筛查应用

说明书

本发明公开了一种荧光纳米传感器标记的拟胚体的制备方法及毒性筛查应用。在毒性筛查方面，这种拟胚体平台相对于二维细胞拥有更为全面的生物反应机制。针对荧光探针难以跨过拟胚体外层致密细胞外基质的问题，本申请先将荧光纳米传感器标记于小鼠胚胎干细胞内，再诱导标记的胚胎干细胞形成拟胚体，以保证传感器的有效摄入。利用PLGA作为传感分子的载体，可实现对传感分子活性的保护和长期释放。通过对细胞浓度的调控我们诱导小鼠胚胎干细胞形成尺寸均一的拟胚体。本发明可以长期实时监测拟胚体内活性氧，生物活性及相关基因表达的变化。

技术领域

本发明属于纳米生物学技术领域，具体涉及一种荧光纳米传感器标记的拟胚体的制备方法及毒性筛查应用。

背景技术

随着工业的不断发展进步，人们对环境安全的议论越发高涨。例如持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，简称POPs) 作为一种有机化学物质越发频繁的出现在人们生活中，由于其化学性质及其稳定，因此具有持久性，生物累积性，和长距离迁移性因而严重威胁人类健康并造成全球性的生态环境问题。多溴联苯醚(PBDEs)作为一种持久性的有机污染物，在许多国家被用作为阻燃剂。2001年全球PFDEs需求量达到76000吨，并保持逐年上升的趋势。作为阻燃剂，PBDEs经常被添加到办公室家具，电器等与我们生活息息相关的材料中。环境种的PBDEs主要通过空气，水及食物这三条途径进入人体。作为一种环境内分泌干扰化合物，它具有类雌激素的作用，可对人体的内分泌系统，神经系统以及甲状腺，大脑，肾脏，肝脏等组织器官产生严重的副作用。对于怀孕群体，子宫内暴露于这种化学污染物会损害胚胎发育，导致发育迟缓或严重出生缺陷，严重可致胚胎死亡。所以建立一个有效的体外有机物毒性筛选平台至关重要。

胚胎干细胞(ESC)是一种具有自我更新能力的多能干细胞，它能通过分化转化为完整三个胚层的细胞类型。由胚胎干细胞体外悬浮培养衍生的拟胚体是细胞的三维聚集体，他包含了胚胎在早期发育过程包含的关键生长变化机制，拟胚体能分化成三个胚层（外胚层，中胚层，内胚层），各个胚层拥有不同细胞的分化能力。拟胚体的这种性能为我们研究体外有机物毒性提供了一个完美的筛选平台。与二维的胚胎干细胞相比，基于三维的拟胚体具有更好的生理相关性。与动物层面相比，拟胚体实验更加简便，成本更低。

但是拟胚体在成型的过程中，它的外层细胞会分泌细胞外基质（ECM）,致密的胶原基质壳会严重阻碍环境外的信号分子进入，使对拟胚体内层生物分子的检测变得困难，且目前的研究多为终点式，难以长期实时检测。

发明内容

为解决致密细胞外基质阻碍信号分子进入的问题，本发明提供了一种荧光纳米传感器标记的拟胚体的制备方法及毒性筛查应用。本发明提供的这种用于毒性筛查的拟胚体平台，满足长期实时监测的需求且检测功能灵活。

为解决上述技术问题，本发明提供一种荧光纳米传感器标记的拟胚体的制备方法，预先将荧光纳米传感器与小鼠胚胎干细胞共孵育，再诱导形成拟胚体，保证纳米传感器的有效摄入。

进一步地，所述荧光纳米传感器的外层壳为聚乳酸羟基乙酸共聚物，通过利用其较好的降解性能，持续释放信号分子，达到长期监测的目的。所述的荧光纳米传感器可以灵活更换装载的信号分子达到不同检测功能的目的。

进一步地，所述荧光纳米传感器的尺寸为1μm，易于降解，生物相容性好。

进一步地，所述荧光纳米传感器与小鼠胚胎干细胞共孵育12h。

进一步地，所述拟胚体的诱导方法为：将小鼠胚胎干细胞在体外悬浮培养，形成大小尺寸均一的拟胚体，单个拟胚体保持1500-2000个细胞数量。

进一步地，所述拟胚体的具体诱导方法包括：

将小鼠胚胎成纤维细胞放置在细胞贴壁培养瓶中培养；

将小鼠胚胎干细胞接种到铺被了小鼠胚胎成纤维细胞的培养瓶中；