[发明专利]一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用

说明书

本发明提供了一种来源于微细正青霉的钙依赖型耐热α‑L‑阿拉伯呋喃糖苷酶，其氨基酸序列和核酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该阿拉伯呋喃糖苷酶基因在瑞氏木霉中重组表达，获得的纯酶(EpABF62C)分子量为33 kDa。EpABF62C具广泛的催化活性，最适温度为65℃、最适pH为4.5，其热稳定性依赖于Ca²⁺，在55℃下稳定5天，在pH2.0‑11.0下稳定，比酶活达205.24U/mg。阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C能协同木聚糖酶高效降解小麦阿拉伯木聚糖，制备低聚糖和单糖。该发明在功能食品、医药保健和生物能源等领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C及其编码基因，制备技术和应用。

背景技术

植物半纤维素是地球上储量仅次于纤维素的生物质资源。木聚糖是半纤维素的重要成分，常见于阔叶木及禾本科植物的细胞壁，是一种复杂的多聚五碳糖。木聚糖的木糖基主链上通常含有阿拉伯糖侧链分支，尤其是谷物麸皮来源的木聚糖的阿拉伯糖侧链含量高达38-45%。木聚糖主链的降解主要由糖苷水解酶（GH）家族10和11中内切型木聚糖酶完成。研究数据显示，木糖残基上的阿拉伯糖取代基对木聚糖主链的降解形成阻碍作用，去除阿拉伯糖侧链基团是高效降解木聚糖的前提。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(alpha-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)是能够催化水解阿拉伯木聚糖或阿拉伯聚糖等高分子上的阿拉伯糖残基非还原端，释放出阿拉伯糖分子的一类酶的总称。在碳水化合物活性酶数据库（http://www.cazy.org/）中，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶分布于糖苷水解酶（GH）家族GH2、3、43、51、54和62家族，不同家族的酶具有差别性的作用特点。例如，GH62家族α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有更高的底物专一性，仅表现出对天然阿拉伯木聚糖的高催化活性。

工业上，以α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶去除木聚糖的阿拉伯糖取代基，进而木聚糖酶作用于木糖残基间的连接键，能够获得木二糖、木三糖等低聚木糖和木糖分子。阿拉伯糖、木糖和低聚木糖具有多种生物活性和功能，已广泛用于医药保健、食品、饲料和生物炼制等领域。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶成为具有重要利用价值的工业用酶资源。耐热酶常具有高的最适催化温度、高的比活性和高的热稳定性，容易实现高效催化和循环利用的目的，在工业应用中备受青睐。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的耐热性已成为评价其应用价值的重要指标之一。

当前，不同来源和类型的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶已有研究报道，但同时具有催化效率高、生产成本低和循环使用等特性，符合市场需求的产品仍然不足。因此，挖掘新颖的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，实现高效率及低成本的制备工艺，明确其酶学特性及工业应用条件，是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源产业化利用的有效手段。

发明内容

发明目的：针对现有市场耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶制剂产品的不足，本发明的目的是提供一种来源于微细正青霉4-14中的钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，使其具有高效的催化能力、良好的热稳定性和pH稳定性。本发明的另一目的是提供上述α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C的制备技术和应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

经蛋白同源性比对发现α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶EpABF62C属于糖苷水解酶家族62成员。其最适pH为4.5，最适温度为65℃，pH稳定性好；钙离子对于该酶的热稳定性具有关键作用，在存在钙的情况下，其在55 ℃下能稳定5天，50℃下能稳定至少7天；该酶对阿拉伯木聚糖的比活性高，对黑麦阿拉伯木聚糖的比活性高达205.24 U/mg。