[发明专利]OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法

说明书

本发明提供了OsALS1的定向突变及农作物内源基因定向进化的方法。OsALS1的氨基酸序列为将序列78发生第一突变、第二突变和第三突变中的至少一种，第一突变为P171F、P171S和P171L中的一种，第二突变为L158F，第三突变为R190H。方法包括如下步骤：选定农作物的内源基因为靶基因；基于靶基因设计若干靶核苷酸序列，得到若干定向进化克隆序列并分别克隆到含有gRNA的质粒上，得到定向进化gRNA质粒库；将所述定向进化gRNA库中的相关序列与Cas9表达盒整合到同一载体上，转化所述农作物中，得到所述农作物的突变库；从所述农作物的突变库中筛选与所述靶基因相关的所需性状。

技术领域

本发明涉及OsALS1的定向突变及一种农作物内源基因定向进化的方法，特别是OsALS1的抗除草剂的定向突变及水稻内源基因定向进化的方法。

背景技术

自然界中，不同物种之间，同一农作物不同品种之间，存在大量的遗传多样性，而这种遗传多样性决定了各农作物关键农艺性状的多样性和商品属性，在长期的农作物的驯化过程中对农作物育种改良和商业应用具有重要的推动作用。因此，挖掘和利用重要农艺性状控制新基因一直都是各农作物遗传改良和新品种培育的首要任务。更有甚者，一个关键新基因的挖掘，可以引起农业上的重大变革，如水稻矮杆基因sd-1，小麦矮杆基因Rht引起了第二次农业绿色革命。但是在实践过程中，自然界中蕴藏的基因变异有限，从自然界种质资源库中挖掘新基因需要花费庞大的人力物力，并且耗时长，所有这些无法满足人口不断增长的人类社会对粮食和各农作物的庞大需求。

水稻作为重要的粮食作物，养活了世界上一半以上的人口。水稻的安全生产和粮食稳定供应是人类社会的重中之重。现代水稻生产已经走向集约化，规模化种植，稻田杂草危害越来越显得严重。传统的人工除草和机械除草，耗时费力、成本高且效率低，使用化学药剂除草的方法效果显著且更省人力物力，由此对具有对除草剂抗性的水稻商业品种需求也显得愈发强烈。近年来，除草剂在农业生产上得到大面积推广应用，有效地保障了我国水稻的稳定生产。

乙酰乳酸合成酶(ALS)，也称为乙酰羟酸合成酶(AHAS)，是植物生长所需的支链氨基酸(缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸)生物合成的第一关键酶。ALS是生产上普遍使用的磺酰脲类(sulfonylurea,SU)、咪唑啉酮类(imidazolinone,IMI)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidine,TP)、嘧啶水杨酸类(pyrimidinylthiobenzoate,PTB)和磺酰胺类(sulfonylaminocarbonyltriazolinone,SCT)五种除草剂的常见靶标位点。这些类型的除草剂都是ALS的强抑制剂，通过阻止支链氨基酸的合成，最终导致植物死亡。ALS抑制剂类除草剂能防治多种杂草，对哺乳动物低毒，并且对主要农作物具有选择性，这些优良的特点使得这类除草剂在全球范围内能够广泛地应用于多种不同的农作物。但是由于除草剂的使用对农作物很容易产生药害，所以在生产上投入使用的时候都比较谨慎，因此为了解决这一问题，开发抗除草剂的水稻就很有必要。传统的开发抗除草剂水稻的方法主要是自然筛选和诱变育种的方法，如EMS诱变，γ射线等理化方法，对水稻进行诱变处理，使水稻中的ALS基因发生突变，随后从诱变产生的后代中筛选获得具有ALS除草剂抗性的水稻，但是需要投入大量的人力和物力通过大规模筛选来分离自然界中的种质。

近几年来，日益发展的基因组编辑技术给现代作物精准育种带来新的方向。该技术通过将作物基因组中的靶基因进行定点编辑(例如DNA片段的缺失、插入或替换等)的方式实现对作物的遗传改良，其颠覆了传统育种方式。尤其是新近发展起来的单碱基编辑技术(胞嘧啶编辑技术CBE和腺嘌呤碱基编辑技术ABE)成功实现了作物基因组中四种碱基的定向转换(碱基对G/C和A/T的互换)，这更是对作物精准育种和基因功能矫正提供了技术支持，加速作物的育种进程。但是，这些碱基编辑器介导的分子育种，仅限于对某些基因功能位点非常清楚的条件下进行基因改造。而基于现有技术，大部分已挖掘到的关键农艺性状控制基因的功能位点还一无所知，这导致对其进行基因改造无从下手。

发明内容