[发明专利]膜蛋白AmtB的表达载体及其表达纯化方法

说明书

本发明公开了一种膜蛋白AmtB的表达载体及其表达纯化方法。所述的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌膜蛋白AmtB序列以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。本发明利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，能够帮助氮端膜蛋白AmtB稳定其构象。本发明构建的表达载体能够实现膜蛋白AmtB的大量表达，可用于后续新型抗生素的高通量筛选。

技术领域

本发明属于蛋白质生产技术领域，涉及一种氨通道蛋白(AmtB)的表达载体及其表达纯化方法。

背景技术

细胞膜是细胞内部与外部的边界，担负着信息传递、能量传输和物质交换的重要功能，是最重要的细胞器。药物作用的靶点经常位于细胞膜上。目前已知50％以上药物作用的靶标是膜蛋白。因此，对于膜蛋白的研究具有非常重要的意义。

然而，膜蛋白由于其天然状态的含量稀少，具有多次跨膜结构，因而折叠容易出现错误，结构复杂，所以膜蛋白的大规模制备一直是难点和热点。在国内，基本没有生物公司可以做到12次以上的跨膜蛋白的表达，只有一两家公司可以做到四次跨膜蛋白的表达。

大肠杆菌作为常用的表达宿主一直是蛋白表达的首选，然而，即使是大肠杆菌自身蛋白都很难在大肠杆菌中大量表达。目前，由于抗生素的滥用，导致在今后的50年内面临无法对抗耐药菌的窘境。因此通过大量表达膜蛋白作为抗生素的作用靶点，能够为后续非变性质谱的高通量筛选提供先导性技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大量表达膜蛋白氨通道蛋白(AmtB)的表达载体及其表达纯化方法。本发明针对大肠杆菌膜蛋白AmtB，建立高效的融合表达系统，可以用于后续进一步的蛋白质非变性实时监控质谱研究。

实现本发明目的的技术方案如下：

本发明的膜蛋白AmtB的表达载体，以本实验室获得的用于莱茵衣藻蛋白质定位的超折叠维纳斯荧光蛋白(中国专利申请201910347575.3)作为起始蛋白质骨架，通过对序列表达所用的密码子组成进行进一步优化，获得分子刚性的荧光蛋白表达标签并且适用于大肠杆菌膜蛋白的大规模表达。本发明利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，并且该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，并且帮助氮端膜蛋白AmtB稳定其构象。

本发明的膜蛋白AmtB的表达载体为表达质粒pLy077-AmtB(SEQ ID NO.2)，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、大肠杆菌膜蛋白AmtB序列(SEQ ID NO.1)以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。

本发明还提供上述膜蛋白AmtB的表达载体的表达纯化方法，具体步骤如下：

步骤1，大肠杆菌膜蛋白AmtB表达载体突变株的制备：将膜蛋白AmtB的表达载体即表达质粒pLy077-AmtB转化到宿主大肠杆菌中，并涂布于含抗生素以及0.1mM IPTG琼脂平板，挑选黄绿色的阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达；

步骤2，将挑选的突变菌株转化株接种至培养基中进行扩大培养，并用1mM IPTG大规模诱导表达膜蛋白AmtB。

优选地，步骤1中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌C43(DE3)。