[发明专利]茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4及其在催化合成β-紫罗酮上的应用

说明书

本发明公开了茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4及其在催化合成β‑紫罗酮上的应用，茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CsCCD4，其核苷酸序列为a、b或c中的任一种：a、如SEQ ID No.1所示，b、与SEQ ID No.1所示核苷酸序列互补的核苷酸序列，c、编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4或茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CsCCD4可应用于催化β‑胡萝卜素生成β‑紫罗酮中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4及其在催化合成β-紫罗酮上的应用。

背景技术

花香可以影响高等植物与传粉者相互作用，也可以起到阻吓食草动物和吸引天敌的作用。作为最传统的无酒精饮料之一，茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)以其温和的口感、宜人的香气及其营养价值在世界享有盛誉。挥发性香气是评价茶叶品质的重要指标，在茶叶生产过程中已发现600多种挥发性化合物，包括脂肪酸衍生物(FADVs)、氨基酸衍生物(AADVs)、挥发性萜烯(VTs)、类胡萝卜素衍生物(CDVs)。在茶叶众多的香气物质中，由类胡萝卜素降解产生的香气物质占成品茶香气总量的4.3-46.5％，是茶叶香气的重要组成部分。这些香气物质大多源自次生代谢途径，例如在类胡萝卜素的生物合成中，以类胡萝卜素提供前体生成的α，β-紫罗酮，β-大马酮等，凭借其极低的气味阈值在茶叶风味中起着关键作用。

在类胡萝卜素的酶促氧化途径中，类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoidcleavage dioxygenases，CCDs)是类胡萝卜素降解的关键酶，在类胡萝卜素的酶促氧化中起着至关重要的作用。

1997年研究人员从玉米中提取得到VP14，并被鉴定为脱落酸(Abscisic Acid,ABA)生物合成途径中的关键酶,Chernys等在拟南芥中鉴定出可以根据不同底物，在9,10和/或9',10' 双键对称地裂解各种类胡萝卜素，形成二醛和C₁₃产物的酶。经过一段时间的研究与鉴定后，研究者们将类胡萝卜素裂解酶基因分为两个亚家族，分别是类胡萝卜素裂解双加氧酶基因 (Carotenoid Cleavage Dioxygenases,CCD)和9-顺式-环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶基因 (nine-cis-epoxy-carotenoid dioxygenases,NCEDs)。CCDs是一类非血红素铁氧合酶，在亚铁离子的协助下，可将类胡萝卜素裂解为脱辅基类胡萝卜素或香气化合物。CCDs在自然界中分布广泛，在原核细胞、动物、真菌和绿藻中具有重要的代谢和激素调节功能，此外，在高等植物中，类胡萝卜素裂解产物也可作为信号参与调控花的香味、果实的颜色和香气，吸引传粉者和传播媒介。其中，NCED是ABA合成途径的关键基因。根据降解底物双键的位置，CCD又被分为CCD1、CCD4、CCD7、CCD8，CCD7和CCD8是合成独脚金内酯的关键基因，CCD1和CCD4可裂解多种胡萝卜素和脱辅基胡萝卜素生成具有花果香气的香气物质。其中，已有文献报道β-紫罗酮是典型的类胡萝卜氧化降解产生的香气物质，它可在茶叶加工过程中通过酶促氧化降解类胡萝卜素得到，是绿茶和红茶重要的香气物质。

β-紫罗酮是一种重要的香料，室温下具有木质香和愉悦诱人的紫罗兰香，在食品、化妆品、烟草和日化用品中有着广泛的应用。GB 2760－96规定其为暂时允许使用的食用香料，主要用以配制树莓、樱桃、葡萄、草莓、黑莓、菠萝等型香精,用于日化、食品香精，香水中，还可大量用于生产维生素A、E和胡萝卜素。

尽管β-紫罗酮已被证实是绿茶和红茶的重要风味物质之一,但茶树中CCDs降解类胡萝卜素生成β-紫罗酮的机理尚不明确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种茶树类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD4及其编码基因，为人工合成β-紫罗酮提供一种新的途径。