[发明专利]一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法及应用

权利要求书

1.一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：通过分期将转基因水稻与杂草稻分别作为花粉供体和受体通过隔行种植或包围种植的方式混种；

当采用隔行种植时，分别收集转基因水稻后代种子与杂草稻后代种子；

当采用包围种植时，只需收集作为花粉受体的后代种子；

S2：收集种子后，采用分步抽样法抽取所需种子用于基因漂移检测，具体如下：

S21：采用随机抽样的方法，从收获的种子中抽取20000粒种子；

S22：若得到的基因漂移率大于0.2％，则不必继续增加抽样量；

若得到的基因漂移率小于0.2％，则需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.05％，则不需要增加种子检测量；

若得到的基因漂移率小于0.05％，还需再检测10000粒种子；在此基础上，若得到的基因漂移率大于0.025％，则不需要增加种子检测量；

S3：对转基因水稻向杂草稻基因漂移率，即正向基因漂移率进行检测，具体如下：

S31：对收获的杂草稻种子打破休眠后进行发芽率检测，把装有100粒种子的培养皿放置于30℃光照培养箱培养7d，测定发芽率，试验重复4次，每种受体材料抽样方法采用S2所述的分步抽样法；

S32：根据作为标记基因的抗性基因，选择对应的抗性筛选方法；将经过筛选出来的幼苗移栽在育苗盘内培养至3叶期，采取叶片，进行分子检测；

S33：计算正向基因漂移率：正向基因漂移率＝[抗性种子数/(检测种子总数×发芽率)]×100％；

S4：对杂草稻向转基因水稻基因漂移率，即反向基因漂移率进行检测，针对的反向基因漂移率小于0.5％时，具体如下：

S41：基于S2所述的分步抽样法，在抽取的转基因水稻种子样本中随机抽样60粒作为一组，并进行脱壳磨样；将脱壳磨样后的样品进行DNA提取；

S42：将提取到的DNA利用Rc基因的扩增引物进行Rc基因检测，根据是否存在104bp和118bp的扩增片段，来判断该样品中是否存在杂草稻向转基因水稻漂移形成的杂交种；若存在104bp和118bp的扩增片段，则该组水稻中存在一粒由于杂草稻花粉漂移到转基因水稻种子产生的杂交种子；

所述Rc基因的扩增引物序列为：

上游引物：5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′；

下游引物：5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′；

S43：重复步骤S41～S42，直至样本全部检测完；并计算反向基因漂移率：反向基因漂移率＝(发生基因漂移的粒数/样本总粒数)×100％；

S5：统计正向基因漂移率和反向基因漂移率，最终得出基因漂移率：基因漂移率＝(正向基因漂移率+反向基因漂移率/2)×100％。

2.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述隔行种植为：在转基因水稻间，间隔5天分4批移栽隔行种植杂草稻；所述包围种植为：一次种植花粉供体，间隔5天分4批围绕种植花粉受体；或一次种植花粉受体，间隔5天分4批围绕种植花粉供体。

3.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S41中：将转基因水稻种子脱壳磨样后过60目筛，进行DNA提取的样品体积为0.5mL，样品重量为0.342～0.377g，DNA浓度为39.8～77.7μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种转基因水稻杂草化基因漂移风险的评估方法，其特征在于，所述步骤S42中，Rc基因扩增的PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 4μL，ddH₂O 3.5μL，上、下游引物各0.25μL，DNA 2μL；其中，2×Taq PCR Mix成分为：dNTP 0.2mmol/L each、KCl100mmol/L、Tris-HCl 20mmol/L、Taq Polymerase 5U/100μL、MgCl₂ 3.0mmol/L。