[发明专利]许氏平鲉肌卫星细胞原位杂交探针引物、探针及定位方法

权利要求书

1.许氏平鲉pax7基因原位杂交探针模板的引物，其特征在于所述引物序列如SEQ.NO 1和SEQ.NO 2。

2.利用权利要求1所述引物构建的许氏平鲉Pax7基因的探针，其特征在于所述探针的序列如SEQ.NO 3所示。

3.利用权利要求2所述的探针进行原位杂交定位许氏平鲉肌卫星细胞的方法，具体步骤如下：

1）取鱼体骨骼肌样品，漂洗后置于无RNA酶的离心管中，样品与质量体积比4%PFA按体积比为1：10的比例混合，颠倒混匀后，保存在4℃固定过夜；2）固定保存后的样品经甲醇梯度进行脱水，最后用100%甲醇溶液于4℃长期保存，作为原位杂交样品；

3）步骤２）所述样品经石蜡包埋、组织切片、苏木精-伊红染色观察组织形态结构；确定形态比较好的组织后，再进行切片、DEPC水中展片、捞片、37℃烘片，切片经二甲苯脱蜡、无水乙醇以及梯度酒精进行复水、洗涤、蛋白酶K消化、固定后用预杂交液进行预杂交，预杂交后用含有许氏平鲉pax7 基因的探针的杂交液在60℃杂交炉中孵育过夜；

4）经过所述步骤3）孵育过夜后，再洗涤，避光显色后终止显色，再洗涤后进一步固定，进行中性红复染，最后在二甲苯透明处理后在显微镜下观察染色结果，实现对许氏平鲉pax7基因在mRNA水平的表达定位，进而实现对许氏平鲉肌卫星细胞的定位。

4. 根据权利要求3所述的方法，预杂交液中的成分及终浓度体积比50%去离子甲酰胺，体积比25% 20xSSC，50ug/ml总RNA，体积比0.1% Tween-20，体积比7.5% 封闭液母液，其余为DEPC水。

5.根据权利要求3所述的方法，所述含有许氏平鲉Pax7基因的探针的杂交液是将预杂交液稀释探针至终浓度为1ng/µl，再将其置于95℃变性5min，变性后待用。

6. 根据权利要求3所述的方法，预杂交后样品与含有许氏平鲉Pax7基因的探针的杂交液混合后于60℃下在原位杂交炉中杂交过夜后，用体积比为1：1的预杂交液与2xSSC混合后洗涤20min、再用过量2xSSC洗涤两次，每次20min；再用过量1xSSC洗涤两次，每次15min；再用过量0.2xSSCT洗涤两次，每次20min；最后在室温下用MAB溶液洗涤两次，每次5min，所述MAB溶液中的成分和终浓度为0.1M马来酸和0.15M NaCl，pH为7.5；杂交处理在洗涤之后，样品用过量的封闭缓冲液于室温下封闭1-2h，而后加入碱性磷酸酶抗体在4℃孵育过夜，再进行洗涤，避光显色，用PBST漂洗，终止显色，再用4%PFA固定后，中性红染色液复染，二甲苯透明处理后，放置于载玻片上，用中性树胶进行封片，在显微镜下观察染色结果，实现对许氏平鲉pax7基因在mRNA水平的表达定位，进而实现对许氏平鲉肌卫星细胞的定位。