[发明专利]一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养、鉴定及诱导分化方法

说明书

本发明涉及一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养、鉴定及诱导分化方法，属于分子生物学领域。本发明培养的许氏平鲉成肌细胞能传代培养，用于研究海水硬骨鱼类肌肉生长的基础研究；能有效的进行体外成肌细胞的诱导分化，为体内单核细胞融合成多核细胞的分子机理研究提供基础。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养、鉴定及诱导分化方法。

背景技术

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)，俗称黑鲪、黑头等，是一种重要的海产经济鱼类和增养殖优良品种，主要分布于我国渤海、黄海和东海。许氏平鲉生存温度范围广，能在深水海网箱越冬，是适合北方深水网箱长年养殖的少数几个品种之一，已广泛养殖于北方沿海的深水网箱，但其生长速度慢，通常需要2-3年才能达到商品规格。生长是对许氏平鲉进行遗传改良最有价值的经济性状之一。鱼类的肌肉占总体重的40％-60％，是主要的食用部分，也是生长性状的核心。研究肌肉生长发育调控相关基因，将为采取相应的技术手段提高肌肉生长速率提供基础。体外培养的肌肉细胞将为研究肌肉生长相关基因的功能验证提供基础实验材料。成肌细胞(Myoblast)是来源于胚胎中胚层的干细胞，具有自我更新和定向分化能力，能够分化形成肌肉细胞。体外培养的成肌细胞可以实现一个完整的肌肉发生过程：增殖、分化、融合和多核肌管的形成。在硬骨鱼中，关于肌肉细胞体外培养的研究主要在鲑类、鲤类和鲷类中进行，但是所培养细胞多为成纤维细胞。与其他脊椎动物相比，海水鱼类成肌细胞的培养及诱导分化方面，尚无相关报道。通过对许氏平鲉成肌细胞的体外培养及诱导分化，将为海水鱼类肌肉生长相关基因的功能验证及生长发育调控机理的研究提供基础实验材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养、鉴定及诱导分化的方法，为许氏平鲉肌肉生长相关基因的体外验证提供了实验材料，为海水硬骨鱼肌肉生长调控的分子机理研究提供了基础。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

一种许氏平鲉成肌细胞的体外培养方法

1)许氏平鲉肌肉组织块的取样及消毒：取小块许氏平鲉背肌，移入装有含4％三抗PBS的50ml离心管中；

2)细胞的原代培养：①将组织块从离心管移到装有含4％双抗PBS的25ml容器中，浸泡5min，再依次过含3％、2％、1％三抗PBS的25ml容器中，浸泡5min，期间，间隔搅拌以便组织块和PBS充分接触、灭菌；②将组织块移到装有含1％三抗DMEM/F12的容器中；将组织块剪为3mm³大小；③将步骤②剪碎后的组织块溶液静置，弃掉上部液体，留下部组织块；加入含1％三抗DMEM/F12重悬组织块，静置，再次弃上部液体，重复三次；④将组织块转移到培养瓶中，并均匀摆放，倒置培养瓶使组织块紧密结合在培养瓶上，随后将培养瓶正过来加入完全培养基；

3)细胞的传代培养：①原代细胞生长到50－60％丰度时即可进行传代，传代的所有细胞仍在原培养瓶中培养,第2代细胞生长到75％丰度时即可传代，原瓶培养；三代之后，当细胞覆盖率达到90％时进行传代，一瓶传两到三瓶；②传代中用到的包括培养基、胰酶、血清在内的试剂应在24℃培养箱中预热0.5h以上；③传代具体步骤：先弃去原培养基，用1ml无血清培养基洗去残留血清、弃去；再加入1ml 0.25％的胰酶处理2-3min，观察细胞的状态，90％的细胞收缩变为圆形时，震动培养瓶使细胞全部漂浮到培养基中，然后加入血清终止胰酶消化；最后加入完全培养基，混匀，吸细胞悬液传代到另一培养瓶中；