[发明专利]酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法

权利要求书

1.酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述的研究方法包括以下步骤：

1)挑选蒺藜苜蓿种子，并进行表面灭菌、催芽和萌发；

2)不同磷浓度条件下，对蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌和蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌分别进行盆栽试验；

3)检测MtPAP2在苜蓿根瘤中的组织特异性表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的组织特异性表达以及磷对MtPAP2基因表达的影响、磷对苜蓿根瘤的影响、磷对苜蓿菌根的影响；

4)利用时空表达、启动子组织定位、超表达、沉默方法研究苜蓿与根瘤菌、菌根真菌共生过程中的作用。

2.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述步骤1)的具体步骤为：

(1)挑选大小均一的蒺藜苜蓿A17种子；

(2)用手术刀片或注射器针头在种子表面轻划一下，肉眼能看到轻微的划痕即可；

(3)将划好的种子倒置100mL无菌的三角瓶中，按照2％V/V比例加次氯酸钠至三角瓶中，轻微晃动3-5min，直至种皮表面出现褐色划痕；

(4)弃废液，无菌水冲洗7-10次，至三角瓶中液体由淡黄色变为无色，最后加入少量无菌水淹没种子，常温放置3h，至种子吸水至饱满状；

(5)弃废液，用无菌水冲洗5遍，然后将种子铺至水琼脂上，最后放置4℃黑暗处理48h；

(6)将含有种子的水琼脂平板倒置放置28℃恒温培养箱，黑暗处理10-12h，直至种子萌发出1cm长的胚根，可用于植物盆栽及苜蓿毛根转化。

3.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌盆栽试验具体步骤如下：

(1)取适量的河砂，用自来水冲洗干净，装入罐头瓶中，一半数量的瓶中倒入适量的无氮营养液，另外一半的瓶中倒入适量的低磷，无氮营养液，牛皮纸封口包紧，121℃灭菌1h；

(2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到罐头瓶中，每瓶种植4颗幼苗，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

(3)待幼苗第一片真叶长出后6-7天，每颗幼苗接种1mLOD600＝0.5-1.0的Sinorhizobiummeliloti1021菌液；

(4)每隔3天分别更换瓶内的无氮营养液和低磷无氮营养液；

(5)在接种Sinorhizobiummeliloti102121天后，收取根样和根瘤样品，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。