[发明专利]一种基因测序芯片的制备方法

说明书

本发明公开了一种基因测序芯片的制备方法，包括以下步骤：S1，将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底，以易于半导体激光光源出射光与光波导层耦合、传输及用于零模波导外延纳米孔结构阵列荧光分子的激发；S2，在基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板，以方便后续将纳米孔外延凸出于光波导层；S3，采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列，以获得陡直度可控的自组装纳米孔阵列，用于基因测序中单分子荧光激发及检测；S4，对外延纳米孔阵列进行后处理，实现外延纳米孔尺度的调整及表面性质的改进；其纳米孔制作工艺相对简单，信噪比更高且光耦合效率高。

技术领域

本发明涉及DNA测序领域，特别涉及一种基因测序芯片的制备方法。

背景技术

基因测序(Gene sequencing，或译基因定序)是指分析特定基因片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的基因测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

自上世纪70年代起,人们已先后发展了三代DNA测序技术。第一代DNA测序技术基于Sanger法，耗时15年完成了人类基因组计划，直接花费约30亿美元，高昂的时间和经济成本令人望而生畏。第二代DNA测序技术以高通量为特点，仅需一周、花费不到100万美元就能完成人类基因组的测序。近年来，基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，在24小时内花费1000美元以下实现单分子实时测序。

单分子实时测序是Pacific Biosciences(CA,USA)推出的一项专利技术。该方法采用四色荧光标记的dNTP和被称为零模波导(zero-mode waveguides,ZMW)的纳米结构对单个DNA分子进行测序。零模波导结构主要是由石英玻璃衬底及表面带有纳米级别直径通孔的金属层构成，大量的纳米孔可以同时制备在同一个芯片上有效提高零模波导的检测通量，零模波导存在一个截止波长，大于该波长的光不能在波导中传播，而是在纳米孔入口处产生消逝波，在入射光大于该截止波长时，纳米孔中没有光传输模式，将这种波导模式称为零模波导。为降低信号噪声，这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，从而使得孔内仅有靠近底部基质的部分被照亮。Φ29DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP(A555-dATP,A568-dTTP,A647-dGTP,A660-dCTP)。当DNA合成进行时，大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光基团被激光照亮，激发荧光，由于结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。

纳米孔目前最重大的应用是测序研究，零模波导纳米孔指的是孔径尺寸在纳米尺度的孔道，通常为50～100纳米。纳米孔因其独特的微观尺寸形貌和孔基材固有的物化属性赋予了它广阔的应用前景，纳米孔技术的开发也是一个广泛研究的领域。

目前的基因测序芯片的纳米孔一般是在基材表面形成的内凹纳米孔，其需要在基材表面通过刻蚀工艺形成内凹纳米孔，工艺复杂，提高了测序成本；

目前基因测序芯片采用的纳米孔的降噪效果不是特别理想，信噪比仍然比较低；

目前单分子测序时采用的激光光源一般外置，体积庞大，成本高，且由于入射光源要激发纳米孔底部的荧光分子才方便确定荧光标记的碱基种类，光源外置的情况下入射光源也不易设置以方便激发纳米孔底部的荧光分子，光耦合效率低；