[发明专利]一种石榴黄化试管苗复绿增殖培养基和培养方法

说明书

本发明涉及一种石榴黄化试管苗复绿增殖培养基和培养方法。本发明的石榴黄化试管苗复绿增殖培养基专门针对石榴黄化试管苗，可使85％以上的石榴黄化试管苗恢复为正常矮壮绿苗，并实现增殖系数达到2.8～4.5，是一种实用高效的培养基。本发明依次采用暗培养、蓝光/暖白光混合培养、暖白光培养进行石榴黄化试管苗的培养，其中光培养阶段采用夹层培养，暗培养调节了光敏色素的形态和比例、促进合成叶绿体前体，蓝光培养加速蛋白质合成、促进形成矮壮苗，LED暖白光中红光光谱比例大，既促进壮苗形成又克服了单色光照射引起的生长弊端，夹层培养克服了培养容器上下产生温度差和内部产生水珠等不利生长的因素。

技术领域

本发明涉及一种石榴黄化试管苗复绿增殖培养基和培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

植物组织培养首次取得成功是在1934年，White用离体番茄根建立了一个活跃生长的无性系。经过近百年的发展，这项技术被广泛应用于植物的脱毒、快繁、外源基因的遗传转化、离体诱变、次生代谢物质的生产、工厂化育苗、种质保存、种质交换等多个方面。培养基配方种类繁多，因植物种类、品种和培养目的不同而千差万别，几乎每个研究成功的物种甚至品种都有自己独特的配方。

试管苗黄化与玻璃化和褐化现象一样，都是组培中常见的问题，表现为整株或部分茎杆和叶片失水、变黄、变软、变脆，不能进行光合作用，无法完成正常的生命周期。究其原因，与母株或再生植株受到病害、盐分胁迫、气体胁迫、温度胁迫、亚铁胁迫、水分胁迫或光胁迫等诸多因素有关；此外，还受季节变化引起的日照长度和空气湿度以及培养架结构是否通风散热良好等因素的影响。即使在技术成熟的植物初代和继代培养过程中，黄化现象也会不定时地、突发性地出现，最严重时发生比例会超过50％，给科研和生产带来巨大损失。

石榴是富含酚类、组培易褐化、易干枯的物种，笔者发现增殖培养基中加入椰汁可以有效避免再生植株黄化干枯现象，再生植株颜色浓绿或鲜绿，生长状况良好，可能与椰汁富含蛋白质、维生素C及钙、磷、铁、钾、镁、钠等矿物质营养有关。在这种培养基上，石榴再生过程均表现良好。但是，笔者发现石榴试管苗仍会不定时地、偶发性地出现黄化现象，比例因季节和品种而异，通常春季夏季秋季和冬季，品种“泰山红”“三白酸”“皮亚曼”“牡丹”，比例高时会达到40％。为了减少科研和生产中的损失，为了有力应对石榴组培中出现的黄化问题，迫切需要一种实用高效的石榴黄化试管苗恢复技术。

黄化试管苗恢复过程中，试管苗会产生一系列生理变化，包括叶绿素的合成、光合机构的形成、新芽的生成等，涉及分化、发育和物质运输等多种生理学现象。

光照的有无、强度以及光质等对黄化试管苗恢复具有极其重要的作用。光照不足，会限制光合碳同化；光照太强，会产生胁迫作用，使叶绿素氧化、褪色、去镁，并形成对膜有害的自由基。但松、柏、莲子胚芽、水稻等植物在黑暗中也能合成叶绿素，葡萄糖促进这一过程；部分植物叶片遮光处理后叶绿素在短期内合成加剧；OsHAL3基因在黑暗条件下可以提高植物耐盐性，并加速植物生长；在活体中，光敏色素Pr和Pfr是动态平衡的，黑暗且水分充足时后者会转化为前者，当两者比例为0.01～0.05时就可以引起显著的生理变化。不同光质诱导叶绿素合成的速率差异显著，可见光中的红光和蓝紫光对光合作用最有效；与白光相比，红光促进叶绿素A的合成、促进生长和代谢；蓝光促进叶绿素B与胡萝卜素的合成，能够抑制徒长、增大繁殖系数、缩短培育周期、形成壮苗；在红叶桃上，红光处理叶片偏红，蓝光处理叶色偏绿，白光处理叶色不良；光特别是蓝光会抑制上述OsHAL3基因在黑暗中的表达。

缺素引起的黄叶在培养基中补充足够浓度的N、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、B、K、钼等元素时，黄化现象会得到缓解并逐渐恢复。番茄叶面喷施磷酸二氢钾可显著提高叶绿素含量及净光合速率。