[发明专利]一种表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种高效表达外源蛋白的CHO细胞的构建方法及其应用，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加所述信号肽序列的所述外源蛋白与Fc通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2)构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。本发明还涉及使用所构建的CHO细胞表达外源蛋白的方法，以及包括该外源蛋白的疫苗组合物。

技术领域

本发明属于细胞系及其制备方法领域，特别涉及经引入外来遗传物质而修饰的细胞及其构建方法和应用。

背景技术

CHO细胞是从成年雌性仓鼠卵巢中分离获得，为上皮贴壁细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，它有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于真核生物天然蛋白；(2)既可贴壁生长，又可悬浮培养，且耐受较高的剪切力和渗透压；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化。

然而，如何提高CHO表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是针对具体外源基因进行特定改造来实现提高外源蛋白表达量，不适合其他的外源蛋白的高效表达，当应用到其他的外源蛋白时，需要对其他外源蛋白的基因重新进行改造，程序繁琐。因此，现实生产中需要一种适用于不同外源蛋白的，操作简单的高效表达方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种高效表达外源蛋白的CHO细胞构建方法，其中，所述方法包括：步骤(1)在外源蛋白序列N端添加信号肽序列；步骤(2)将添加信号肽序列的外源蛋白序列与Fc 序列通过融合连接在一起，构建表达质粒；步骤(3)将所述步骤(2) 构建的表达质粒转染CHO细胞；以及步骤(4)外源蛋白的收获。

在步骤(4)中，包括筛选产量较高的克隆株；对所得克隆株进行稳定性评估和产率评估，以便选择稳定性较好且细胞生长特性好、蛋白产量较高的克隆株用于生产。

本发明方法使得外源蛋白高效表达，能较CHO常规表达显著提高外源蛋白的表达量，且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，可广泛适用于多种兽医疫苗蛋白，无需对外源蛋白的基因进行优化，具有广泛的适用范围。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(1)中信号肽序列如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQ ID. No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQID.No.6、SEQ ID.No.7、 SEQ ID.No.8、SEQ ID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID.No.11、SEQID. No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示。如SEQ ID.No.1、SEQ ID.No.2、SEQID.No.3、SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.5、SEQ ID.No.6、 SEQ ID.No.7、SEQ ID.No.8、SEQID.No.9、SEQ ID.No.10、SEQ ID. No.11、SEQ ID.No.12、SEQ ID.No.13或SEQ ID.No.14所示的信号肽可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的信号肽序列。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述CHO细胞构建方法中，所述步骤(2)中Fc序列如SEQ ID.No.15或SEQ ID.No.16所示。如SEQ ID.No.15所示的Fc序列和如SEQID.No.16所示的Fc序列可以任选地应用到高效表达某种特定外源蛋白的CHO细胞构建方法中，不限于各个实施例所使用的特定的Fc序列。