[发明专利]一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法

权利要求书

1.一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(1)富集卵巢癌A2780成球细胞；

(2)ALDEFLUOR^TMAssay流式分选卵巢癌干细胞，流式细胞仪设置和数据采集。

2.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述步骤(1)采用无血清悬浮细胞培养法富集卵巢癌A2780成球细胞。

3.根据权利要求2所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述步骤(1)无血清悬浮细胞培养法的详细操作是：复苏人卵巢癌A2780细胞株，使用完全培养基(含10％胎牛血清)中培养传代，待其生长至贴壁面积达80％,使用0.05％胰酶/EDTA消化5分钟，1000rpm离心5min,收集A2780细胞沉淀，使用无血清培养基重悬，无血清培养基含DMEM-F12、Glutamax^TM、丙酮酸钠、B27、EGF、bFGF、胰岛素，双抗、预防支原体的药物Plasmocin^TM及ROCK抑制剂Y27632，置于低吸附培养瓶进行连续悬浮培养，富集A2780细胞球，每3天添加一次2ml无血清培养基，每7天细胞传代1次，培养过程中使用倒置显微镜观察A2780细胞球富集情况，共培养三周。

4.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述步骤(1)采用顺铂细胞培养法富集卵巢癌A2780成球细胞。

5.根据权利要求4所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述步骤(1)顺铂细胞培养法的详细操作是在完全培养基(含血清)中培养卵巢癌细胞A2780,待细胞长满培养皿底部后，弃掉原培养基，用PBS洗2次，加入无血清培养基，加入顺铂，第二天继续添加顺铂，第三天继续添加顺铂，培养72小时后使用无血清培养基换液，用PBS洗2次，培养7天左右光镜观察A2780细胞成球形态。

6.根据权利要求4所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述步骤(1)每次加入的顺铂的终浓度为0.5μg/ml。

7.根据权利要求1所述的一种人卵巢癌干细胞富集及流式分选的方法，其特征在于：

所述ALDEFLUOR^TMAssay流式分选卵巢癌干细胞的详细操作是：

①激活ALDEFLUOR^TMAssay；

②细胞样品制备：收集A2780悬浮培养细胞球到15ml离心管，离心(1000rpm，3min)；PBS冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)；加入1ml TryplE^TMExpress胰酶重悬，枪头轻柔吹打，消化为单细胞悬液，离心(1000rpm，3min)；PBS冲洗一遍，离心(1000rpm，3min)，使用ALDEFLUOR缓冲液重悬细胞，细胞密度调整为1×10⁶细胞/mL。

③ALDEFLUOR^TM测定：每个样品管加入1ml细胞悬液，再加入5ul活化ALDEFLUOR^TM试剂到样品管中，混匀后并立即将0.5ml的混合物转移到阴性对照管，在阴性对照管中加入5μlDEAB试剂。37℃孵育样品30-60min。孵育后,离心(250g，5min),弃上清；使用2％胎牛血清+2％双抗ALDEFLUOR^TM检测缓冲液1ml重悬，过200目筛网(以免团聚细胞堵塞流式滤嘴)，加入流式管中。整个过程冰上操作；流式分选前轻弹流式管使细胞分散；准备2支流式管，分别装3ml无血清培养基(2％双抗)，回收分选后细胞；

④流式细胞仪的设置和数据采集。