[发明专利]一种核酸提取方法及其用途

说明书

本发明涉及一种核酸提取方法，所述方法包括：a.根据核酸上的目的核酸序列设计探针；b.将所述探针与固相载体连接，得到捕获载体；c.将所述捕获载体与样品混合，通过温度变化，使所述捕获载体与样品中的靶核酸结合；d.将捕获载体从样品中分离，通过温度变化将核酸与捕获载体解离，收集核酸。其中，靶核酸可以是cfDNA、基因组DNA或RNA。本发明采用杂交法对样品中的靶核酸进行提取，能够实现特定基因片段的靶向富集和提取，有利于降低后续的检测背景；通过调整野生型或者突变型探针的比例，使提取产物中突变型基因片段的比例上升，便于后续对低比例突变的检测，可大大提高检测灵敏度；并且本发明方法操作过程简单，有利于自动化操作。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种核酸提取方法，特别是涉及一种低丰度突变核酸的提取方法。

背景技术

提取生物样本中的核酸对目的核酸序列进行检测在产前诊断、肿瘤诊断筛查和预后检测以及免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察等领域具有重要意义，但相关样本中核酸的丰度一般较低，需要对其进行提取纯化。

目前市场上多数核酸纯化试剂盒是通过硅胶膜离心柱或者表面经过特殊标记处理的磁珠进行纯化。该纯化原理是在高盐和低pH的溶液条件下，硅胶膜和磁珠能专一性的吸附核酸，由此将样本中的核酸吸附到硅胶膜或者磁珠之类的固相载体上；然后使用含有胍盐（盐酸胍或者异硫氰酸胍）的酒精溶液进行洗涤，去除固相载体上的蛋白质、脂质和盐离子；由于在低盐以及较高的pH溶液条件下，结合在硅胶膜或者磁珠上的核酸会与它们分离，最后用去离子水或TE buffer（Tris-EDTA）进行洗脱，即得。如果目的核酸在样品中含量相对较少，为了提高核酸提取产量，一般在提取试剂盒中准备Carrier RNA，在提取的过程中将Carrier RNA加入到样品中，有利于核酸与固相基质（硅胶膜或者磁珠）结合，从而提高核酸的整体提取效率。

然而这种纯化方法并不适用于核酸浓度较低的样品，基于这种提取方法的整体提取效率并不高，进一步地，比如在用于肿瘤的个体化用药指导和预后的核酸检测方面，突变核酸只占总核酸的一小部分，用这种传统方法所提取得到的核酸包含了人类基因组中所有的DNA片段，这些DNA片段在后续的检测（包括PCR、测序和杂交检测）过程中，绝大多数都是背景噪音；此外，这种传统的提取方法需要较多的提取步骤，在提取的过程中需要用到多种化学试剂，不便于自动化操作。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种核酸提取方法，特别是用于低丰度突变的核酸提取方法，所述方法包括：a 根据核酸上的目的核酸序列设计探针；b 将所述探针与固相载体连接，得到捕获载体；c 将所述捕获载体与样品混合，通过温度变化，使所述捕获载体与样品中的靶核酸结合；d 将捕获载体从样品中分离，通过温度变化将核酸与捕获载体解离，收集核酸。

本发明的靶核酸为cfDNA、基因组DNA或RNA。cfDNA，即循环游离DNA或者细胞游离DNA（Circulating free DNA or Cell free DNA，cfDNA），是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。相比组织样品中基因组DNA含量而言，血清或血浆样品中cfDNA的含量很低，血液中cfDNA的来源主要是细胞凋亡、死亡和正常细胞的主动外排，来自肿瘤细胞的cfDNA也就是要检测的ctDNA(circuling tutor DNA)只占所有cfDNA的一小部分。

本发明所述探针包含DNA探针或PNA探针。PNA（Peptide nucleic acid，肽核酸）是一种人工合成的类似于DNA，RNA的化学物质；PNA的骨架是由重复的N-2-(氨乙基)-甘氨酸为单位，经由肽键组合而成；碱基与骨架之间是以亚甲羧键相连，与多肽相似的是，PNA也有N端和C端的差别。