[发明专利]实时电子测序

说明书

描述了实时电子测序，包括方法、装置和系统。使用包含具有一个或两个电极的电容装置的纳米电子元件的阵列或纳米FET装置的阵列来提供聚合酶‑模板复合物中模板核酸的序列信息，所述复合物结合至纳米级电子元件附近或结合至纳米级电子元件附近的基材。在聚合酶介导的核酸合成的条件下将包含具有阻抗标记物、电容标记物或电导标记物的核苷酸类似物的测序反应混合物导入包含电容装置或纳米FET的纳米级电子元件的阵列。使用测量的阻抗、电导或电容通过鉴定掺入生长链的核苷酸类似物的标记物的类型来确定核苷酸类似物掺入的时间顺序。

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年9月20日提交的临时专利申请号61/880,293和2013年5月6日提交的临时专利申请号61/820,066的权益，其通过引用纳入本文用于所有目的。

关于联邦资助研究/开发的声明

不适用。

技术领域

本申请属于生物学和分子医疗领域，具体涉及实时电子测序技术及其应用。

背景技术

核酸序列数据在生物学研究和分子医疗中的许多应用中是有价值的，包括测定疾病中的遗传性因素，开发新方法以检测疾病并指导治疗(van de Vijver等(2002)A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer,(作为乳腺癌中存活预测的基因表达特征)New England Journal of Medicine 347:1999-2009)，以及提供个性化医疗的合理基础。获得并验证用于这类分析的序列数据促使测序技术需要经历进步以扩大通量、减少试剂和劳动成本并提高精确性(参见例如，Chan等，(2005)Advancesin Sequencing Technology(测序技术中的进步)(综述)Mutation Research 573:13-40，其全文纳入本文用于所要目的)。

使用了多种测序方法且各自具有其优势和劣势。单分子实时测序优于其他测序方法，包括提供较长读取长度的能力。许多目前的测序方法使用光学标记物。需要使用非光学读取的改进的测序仪器和方法，且尤其是具有这些特性的实时单分子测序方法。

已阐述了单分子和单颗粒的电子检测，包括通过电容、阻抗和电导方法。本发明提供了用于非光学实时单分子测序的仪器、装置和方法。

发明内容

在一些方面中，本发明提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含可测量阻抗的纳米级电子元件的阵列的基材，其中多个纳米级元件包含与纳米级电子元件接合或靠近的单个聚合酶复合物(包含聚合酶和模板核酸)；将该基材暴露于多种类型的核苷酸类似物，各类型包含与核苷酸类似物的磷酸部分相连的不同的阻抗标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致掺入核苷酸类似物和切割相应的阻抗标记物，并导致新生核酸链的生长；测量多个纳米级电子元件中每一个处的阻抗，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的阻抗标记物生成纳米级电子元件处可测量的阻抗变化；随时间监测多个纳米级元件处的阻抗，阻抗的变化表示某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用随时间测量的阻抗鉴定掺入的核苷酸类似物的类型以确定模板核酸的序列。

在一些情况中，这些纳米级电子元件测量电容、电导或电容和电导的组合。在一些情况中，这些纳米级电子元件包括纳米FET装置。在一些情况中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些情况中，纳米FET的栅包含掺杂硅。

在一些情况中，该基材暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同的阻抗标记物。在一些情况中，该阻抗标记物与聚磷酸部分通过接头相连。在一些情况中，该阻抗标记物包含电容标记物或电导标记物。