[发明专利]创制水稻低糊化温度新种质的方法及其应用

说明书

本申请公开了创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括修饰水稻中的ALK基因，使其第八外显子发生缺失或插入突变。本申请还公开了通过所述方法创制的水稻用于育种或改良种质资源的用途，能够靶向水稻ALK基因的sgRNA，以及能够靶向水稻ALK基因的CRISPR/Cas9编辑载体。本申请为水稻精米糊化温度新种质的创制及培育高米质水稻的育种实践提供一种行之有效的操作方式。

技术领域

本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制ALK基因突变体来提高水稻淀粉碱消值、降低水稻淀粉糊化温度的方法。

背景技术

水稻作为我国乃至全球最重要的粮食作物之一，其产量不断提高。随着人们生活水平的日益提高，市场对大米的要求逐渐转向优质化和专业化。大米的蒸煮食味品质是优质化的主要评价指标。米粉糊经过加热，淀粉粒开始迅速吸水膨胀，大多数淀粉粒丧失其特有的偏振十字图形，变得更透明，黏滞性上升，有更多的可溶性物质进入水中, 此现象称为糊化(Gelatinization)，此时的温度称为糊化温度 (Gelatinization temperature，GT)。糊化后的淀粉，在黏度、强度、韧性等方面更加适口，因此GT是影响大米蒸煮和食用品质的一个重要参数。GT依品种而异，糯稻低，籼稻高，一般分为低(55～69.5℃), 中(70～74℃)和高(74.5～79℃)三等。

在审定中，由于大米的蒸煮食味品质难以量化，一般通过相应的理化指标来评价大米的蒸煮食味品质。目前，本行业公认的5种稻米理化性状指标为：直链淀粉含量、胶稠度、蛋白质、碱消值(alkali spreading value，ASV)和粒型。其中，碱消值是衡量糊化温度的指标，也是国家评价优质食用稻的关键性指标。通常，碱消值与GT呈反向相关，碱消值越高GT越低。在农业部新标准NY/T 593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻的一级二级米都要求碱消值大于6。由于碱消值无法在大田中进行筛选，利用常规育种手段改良碱消值耗时长、成本高且效率低。利用生物技术快速改良碱消值对于水稻育种优质化的目标有重大意义，也具有很大的商业前景。

发明内容

为解决上述技术问题，本申请提出一种改变水稻碱消值或糊化温度的新思路，同时提供一种简便有力的实施方案，即利用CAS9基因编辑技术对水稻ALK基因的第八外显子进行定点编辑，快速地获得不同突变类型的ALK突变体，并从中筛选出碱消值升高的突变体材料，创制消费市场上更受亲睐的新种质。为实现上述目的，本申请采用如下技术方案。

在第一方面，本申请提供了创制水稻低糊化温度新种质的方法，其包括修饰水稻中的ALK基因，使其第八外显子发生缺失或插入突变。

在优选的实施方案中，所述修饰使ALK基因的第八外显子的单核苷酸多态性位点发生缺失或插入突变。

在一些实施方案中，所述修饰通过基因编辑进行。

在一些实施方案中，所述ALK基因包含以下序列或由以下序列组成： SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列，或者编码 SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性的保留其功能的活性变体序列的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，所述水稻为籼稻或粳稻。

在一些实施方案中，所述基因编辑通过选自以下的序列特异性核酸酶中的一种或多种进行：CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12a、 TALEN、大范围核酸酶和ZFN。优选地，所述基因编辑通过CRISPR/Cas9 进行。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9包含Cas9，其中所述Cas9 包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、95％、99％或更高的序列同一性并编码相同功能的蛋白质的活性变体序列。