[发明专利]基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用

权利要求书

1.一种用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视化检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号；

其中，所述的可检测信号包括荧光信号，或不需要仪器而直接裸眼可见的信号；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子即ssDNA-reporter，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1或BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

2.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述核酸探针的一端带有标记荧光基团JOE，而另一端带有淬灭基团BHQ1。

3.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为2-200 μM。

4.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为4-100 μM。

5.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为5-50 μM。

6.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。

7.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含特异的核酸扩增引物对。

8.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。

9.如权利要求6所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有：

(e1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；

(e2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；

(e3)任选的用于反转录的反转录酶；

(e4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。

10.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的ssDNA-reporter的碱基进行的修饰为在3'端标记淬灭基团BHQ2。

11.如权利要求3所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，5'JOE-N₁₂-3'BHQ2被作为荧光或裸眼可视化的报告分子使用时，浓度为2-200 μM。

12.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。