[发明专利]一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用

说明书

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种聚糖酶及其在川芎嗪生物合成中的应用。本发明的聚糖酶是采用简并密码子替换聚糖酶中的部分核苷酸，实现密码子优化，提高其催化活性；本发明还提供乙偶姻的制备方法，使用表达该聚糖酶的微生物细胞进行全细胞催化，制备乙偶姻，并可以进一步制备川芎嗪。本发明的方法底物转化率高，产量高，降低了成本，适用于工业化生产。

技术领域

本发明属于生物合成领域，具体涉及一种聚糖酶及其在2,3,5,6-四甲基吡嗪生物合成中的应用。

背景技术

2,3,5,6-四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine,TMP)又叫做川芎嗪，是一种含氮杂环化合物。它是一种无色结晶化合物，熔点为80-82℃，易溶于乙醇、丙二醇等有机溶剂，微溶于乙醚。川芎嗪具有特殊的焦甜味、坚果味和烘焙味，存在于坚果、可可豆、咖啡等深受人们喜爱的食品中。另外，它也是白酒中的一种重要成分，不仅有助于增强酒的香味，而且在一定程度上有益健康。川芎嗪是一种公认的安全物质，是国家标准允许使用的食品添加剂，最大添加浓度为10mg/kg。

此外，川芎嗪是传统中药川穹的有效成分，具有扩张血管、轻度降压、抑制血小板黏附聚集和血栓形成、抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增生等较为良好的药理作用，现在临床上主要用于治疗闭塞性血管疾病，如脑栓塞、冠心病、心绞痛、脉管炎、慢性肺心病、慢性肾功能衰竭等。据中国化学制药工业协会报道，2018年度18个心脑血管类药物12个品种同比增长，其中注射用葛根素、注射用盐酸川芎嗪和注射用磷酸川芎嗪列产量前三位。而注射用盐酸川芎嗪冻干粉针剂(折算标准40mg)产量为6591万瓶，同比增长47.1％。数据显示，丹参川芎嗪注射液在2018年公立医疗机构终端销售额为40.78亿元人民币。

川芎嗪的生产方法主要包括植物提取法、化学合成法和生物发酵法。从植物组织提取吡嗪的方法包括有机溶剂法、超临界CO₂萃取法、高速逆流色谱技术等；化学合成法是现在国内外工业化生产川芎嗪的主要方式，其中美拉德反应会产生吡嗪类物质，Osulosekh路线会产生很多中间体，经过后续高级阶段的反应会生成大量的川芎嗪，化学合成法大多以2,3-丁二酮，2,3-丁二胺或者丁酮与亚硝酸乙酯为原料合成；微生物法通过高产菌株的筛选而后微生物发酵生产川芎嗪，如从枯草芽孢杆菌的发酵液中分离提纯川芎嗪。

目前，从植物组织提取川芎嗪，由于原材料的短缺，很难满足市场需求。化学合成法是现在国内外工业化生产川芎嗪的主要方式，但化学反应会涉及自由基反应，并且会带来一些环境问题。并且，由于化石原料供应的短缺，化学合成使用原料的价格也在不断上涨。同时，消费者更倾向于使用天然产品，尤其是在食品、药品和化妆品行业中。微生物发酵生产作为一种安全高效的生产方式，近年来越来越受到人们的关注。然而，目前使用微生物发酵法生产的川芎嗪产量都比较低，而高产的菌株又很难获得，这成为生物法合成川芎嗪的瓶颈。

Zhang等从乙醇出发，经乙醇脱氢酶反应形成乙醛，再经聚糖酶(Formolase)突变体FLS:L482S催化乙醛合成乙偶姻。该方法采用的是纯酶反应，产量低，成本高。

发明内容

为改善上述技术问题，本发明的第一方面提供一种聚糖酶(FLS)，其是将SEQ IDNO.1所编码的氨基酸序列5’端的12个氨基酸由简并密码子替换所得，所述聚糖酶相比于未替换密码子的聚糖酶在细胞中的表达增强，全细胞催化活性增强。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶是由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种聚糖酶突变蛋白，其氨基酸序列是在对应于SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列第21位的组氨酸H突变为谷氨酰胺Q(H21Q)。

根据本发明的实施方案，所述聚糖酶突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述聚糖酶突变蛋白可以由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码。