[发明专利]一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用

说明书

本发明公开一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。该培养基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal为基础培养基，还包括以下组分：B27，N2，血清替代物，谷氨酸盐,非必需氨基酸,双抗,β‑巯基乙醇，LCDM,WNT通路抑制剂和ROCK抑制剂。采用该培养基结合基质胶体系对人多能干细胞进行培养，可将其成功转化成人扩展多能干细胞。该培养基化学成分明确，可以逆转人多能干细胞命运，将人多能干细胞转化为具有双向嵌合能力的扩展多能干细胞，操作简单，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于干细胞和再生医学领域，具体涉及一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。

技术背景

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，存在两种不同类型的细胞，分别为全能(totipotent)细胞和多能(pluripotent)细胞。全能细胞具有最优越的发育潜能，能产生包括胚胎内和胚胎外组织在内的整个胚胎结构，而多能细胞只能发育为胚胎内组织。目前，桑葚胚之前的卵裂球被认为是全能的，在胚胎的第一个谱系特化过程中逐渐失去全能性并转变为多能性。多能性的胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)或者诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)已经被建立并大量研究，而全能性细胞，尤其是人类全能性样细胞，能否在体外稳定维持是一个长期以来试图解决的问题。

在2017年，Yang等报道成功地在化合物小分子混合物培养基中维持了一种具有双向嵌合能力细胞。具体而言，他们发现由人LIF、GSK3抑制剂CHIR 99021、DiM和MiH(称为“LCDM”)组成的混合物培养基在有饲养层细胞支持下可以支持人传统ESC转化和维持立体克隆形态的扩展多能干细胞(extended pluripotent stem cell，EPSC)。这些细胞表现出广泛的发育可塑性，在嵌合体实验中不仅可以高效贡献于胚胎组织，还可以贡献于胚胎外组织。这一开拓性的工作，无论在发展潜力还是研究意义上，都产生了相比于其它多能干细胞不可替代的细胞类型。然而，该转化条件用到了小鼠来源的饲养层培养体系。饲养层细胞的存在会带来不确定因素，包括成分复杂性和不同批次之间的差异性，影响了进一步的分子机制探讨和潜在的临床应用。可见，建立不依赖饲养层细胞、成分明确、简单快速的体系获得扩展多能干细胞将极大拓展对于全能细胞的认识及将来的实际应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用。该培养基化学成分明确，可以逆转人多能干细胞命运，将人多能干细胞转化为具有双向嵌合能力的扩展多能干细胞，操作简单，具有良好的应用前景。

为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

提供一种将人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的培养基，所述培养基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal为基础培养基，含有以下组分：1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，10ng/mLrecombinant human LIF,1μM CHIR99021,2μM(S)-(+)-Dimethindene maleate,2μMMinocycline hydrochloride,0.5-5μM WNT通路抑制剂和1-10μM ROCK抑制剂。

按上述方案，所述WNT通路抑制剂为IWR-endo-1；所述ROCK抑制剂为Y-27632。

按上述方案，所述培养基还包括EZH2抑制剂。

按上述方案，所述EZH2抑制剂为GSK126，在培养基中的浓度为0.5-5μM。

按上述方案，所述培养基还包括糖酵解抑制剂，主要用于人多能干细胞向扩展多能干细胞转变的晚期阶段，所述晚期阶段为扩展多能性维持过程阶段。