[发明专利]靶向肿瘤细胞表面MUC1的新型嵌合抗原受体及MUC1嵌合抗原受体T细胞的制备方法

权利要求书

1.一种靶向肿瘤细胞表面MUC1的新型嵌合抗原受体,其特征在于，所述的靶向肿瘤细胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受体由位于胞外的结合肿瘤细胞表面抗原MUC1的单链抗体scFv、跨膜区和位于胞内的T细胞的活化基序所组成，构建新型融合基因anti-MUC1-scFv-CD28-CD137/4-1BB-CD3ζ，所述的新型嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述的靶向肿瘤细胞表面MUC1的新型嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）MUC1.28.BB.z CAR基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定；

（2）新型抗MUC1CAR重组慢病毒的制备；

（3）新型MUC1.28.BB.z CAR-T细胞的制备。

3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤细胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）MUC1.28.BB.z CAR基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定由以下步骤组成：

（A）MUC1.28.BB.z CAR融合基因的设计：融合基因结构为EcoRI-Kozak 序列-Igκ信号肽-VL-linker-VH-CD8 hinge-CD28跨膜区-CD28胞内区-CD137/4-1BB-CD3ζ-BamH I， 其中Igκ信号肽、CD8基因的hinge、CD28基因的跨膜区和胞内区、CD137/4-1BB基因、CD3ζ 基因的序列均参考Genebank（NCBI），VL和VH为人源化MUC1抗体scFv中的可变区轻链和可变区重链序列部分；

（B）慢病毒表达质粒的构建：MUC1.28.BB.zCAR融合基因DNA片段经EcoRI和BamHI双酶切后插入PLVX-EF1a-IRES.ZsGreen慢病毒表达质粒中，产生的PLVX-EF1a-anti-MUC1CAR.IRES.ZsGreen质粒经过EcoR I和BamH I双酶切鉴定后， 经测序确证。

4.根据权利要求2所述的靶向肿瘤细胞表面抗原MUC1的新型嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）新型抗MUC1CAR重组慢病毒的制备由以下步骤组成：

（a）MUC1.28.BB.z CAR重组慢病毒的包装：在10cm培养皿中铺7X10⁶个293T17细胞，培养液用含有1%青霉素-链霉素和8%胎牛血清的DMEM 培养基，37℃，5%CO2培养过夜，16-24h后，10cm皿中293T17细胞覆盖率达到70-80%时进行转染，转染前提前2h换成6mL无青霉素-链霉素的培养液，转染时按照目的质粒，包装质粒：包膜质粒质量比例为4：3：1，分别取重组慢病毒表达质粒PLVX-EF1a-anti-MUC1 CAR.IRES.ZsGreen1、PsPAX2和PMD2G加入1.5mL离心管中，再加入转染试剂聚乙烯亚胺（PEI），质粒：PEI=1：3，充分混匀后将上述混合物逐滴加入10cm皿中，37℃，5% CO2培养过夜，转染后16小时换液，加入5 ml新鲜培养液；

（b）MUC1.28.BB.z CAR重组慢病毒的浓缩、纯化：换液24h后， 收集第一次病毒上清液于50mL离心管中，加入5 ml新鲜培养液于被转染的293T17细胞中， 3000rpm,10min低速离心病毒上清液以除去细胞碎片，再用0.45um低蛋白吸附滤膜过滤除去杂质，存放于4℃，待进行病毒浓缩， 24h后收集第二次病毒上清液进行与上述同样处理，将上述经过初步处理的病毒液加入含有20%蔗糖溶液的超速离心管中，蔗糖：病毒液=1:4,82700g，4℃离心2h，弃上清，病毒沉淀块用1/100病毒原液体积的RPMI-1640培养基重悬，然后将浓缩病毒液移至1.5mL离心管中，14000rpm离心1分钟， 进一步纯化，吸取上清液即可用于转导细胞，或分装储存于-80 ℃保存；

（c）MUC1.28.BB.z CAR重组慢病毒的滴度测定：在24孔培养板每孔铺7X10⁴个293T-17细胞，500uL培养液，共设置8个孔，1孔用做转导前细胞计数，1孔用做未转导对照孔，其余6孔分别用作Vector和MUC1.28.BB.z CAR病毒转导的倍比稀释孔，细胞覆盖率为30-40%时进行转导，转导后24h换液，转导后72h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达，选取绿色荧光蛋白GFP表达阳性率介于5%-20%的稀释倍数孔做流式检测。