[发明专利]一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测凋落物β‑葡萄糖苷酶活性的方法，属于生物化学技术领域。本发明提供的检测凋落物中β‑葡萄糖苷酶活性的方法主要步骤为：称取剪碎过筛的凋落物到离心过滤管中，加入培养缓冲液进行孵育，高速离心后混合上清液并调节至一定体积作为酶活待测液；将酶活待测液和灭活的酶活待测液分别加入样品活性孔和阴性对照孔，再加入荧光底物工作液4‑MUB‑β‑D‑葡萄糖苷溶液，在避光条件下震荡孵育；再向酶标孔加入Tris终止液；采用多功能酶标仪进行荧光检测；计算β‑葡萄糖苷酶活性。本发明的优点为：反应体系优化后，灵敏度高，检测消耗待测酶液的量少，缩短了操作时间，短时间内能大批量获得测定数据，操作简单，效率高。

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，更具体地说，涉及一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法。

背景技术

凋落物分解是森林土壤物质转化的基础，是植物和微生物养分的主要来源，在维持森林生态系统碳及养分循环中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要贡献者，在凋落物降解的过程中，凋落物上定殖的微生物会分泌各种胞外酶，改变凋落物的组成结构，从而促进凋落物的降解。作为参与凋落物分解最为重要的生物活性物质，酶活性涉及各种生物化学过程，与凋落物的分解直接相关，在很大程度上反映了土壤C、N、P等养分循环状况，且因凋落物类型及环境条件的不同而异。研究凋落物中各种酶类活性在凋落物分解过程的活性动态，对了解森林凋落物分的微观生态过程具有重要意义。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)即纤维二糖酶，主要作用是水解凋落物中的纤维二糖、纤维三糖及水溶性纤维糊精并转化为葡萄糖。虽然β-葡萄糖苷酶对纤维素无直接作用，但是其可以消除对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶反应终产物的反馈抑制作用，是纤维素降解过程中的关键限速酶。由于凋落物中纤维素的降解与土壤腐殖质的形成具有一定的关联性，因此，β-葡萄糖苷酶活性可以一定程度上反映土壤中生物化学的强度和动态过程，是评价土壤肥力高低的可靠指标。同时，土壤微生物的分解和释放是β-葡萄糖苷酶的主要来源，在研究土壤微生物群落特征中不可忽视β-葡萄糖苷酶活性与之的联系和作用，可将其酶活性作为微生物活性较为稳定和灵敏的一个指标。

我国凋落物β-葡萄糖苷酶活性的测定是在土壤酶学方法基础上的延伸，但对森林凋落物β-葡萄糖苷酶活性测定的研究存在着方法粗放单一、与国际先进方法脱轨、实验设备更新换代较慢以及以纤维素酶总酶活代替β-葡萄糖苷活性等诸多问题。其中以水杨苷作底物的Barush和Swiain法，酶解产物用4-氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定，但反应易受干扰，且检测灵敏度低；以硝基苯基-β-葡萄糖苷为底物进行酶解的比色法应用普遍，该方法虽操作简单，重现性好，但是易受干扰，消耗的酶液过多，且整体耗时过长。并且由于森林中原有凋落物构成复杂：可能有的表层凋落物没有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外β-葡萄糖苷酶少，也有可能有的凋落物已经处于降解末期。这种复杂情况不利于多种样本之间进行比较研究酶活性及其变化差异，因此凋落物酶活性的检测比土壤酶活测定在前期也需要更多人工干预，使之标准化，以利于凋落物降解过程的研究。

综上，目前需要提供一种新的、标准化、快速便捷的凋落物β-葡萄糖苷酶活性的检测方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测凋落物β-葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步骤：

1)将培养缓冲液加入剪碎过筛后的待测凋落物，于离心过滤管离心得到酶滤液，将酶滤液进一步稀释制成酶活待测液；

2)将步骤1)中制得的一部分酶活待测液进行加热灭活，制成灭活酶液；

3)配制梯度浓度的MUB荧光标准物质溶液，采用多功能酶标仪进行荧光检测；