[发明专利]一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，涉及凋落物酶活性检测的技术领域。该方法包括以下步骤：1)制备待测凋落物酶活性液与灭活酶液；2)制作MUB浓度与吸光值之间关系的标准曲线；3)将酶活性液和灭活酶液分别添加到酶活性孔和阴性对照孔，然后加入4‑MUB‑β‑D‑磷酸酯工作液，避光震荡孵育，反应结束后加入终止液终止反应，在检测条件下，读取荧光值；4)根据标准曲线，计算酸性磷酸酶比酶活。本发明干扰因素减少，反应体系优化，实验强度减少；数据结果精准，重现性好，尤其适合酶含量较低的半降解凋落物的酶活测定；且采用了改进后的通用缓冲液以及Tris终止液，更有利于处理间数据结果的比较。

技术领域

本发明涉及凋落物酶活性检测的技术领域，具体涉及一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法。

背景技术

森林凋落物是森林系统一种重要结构和功能单元，是物质循环和能量流动的重要环节。凋落物的分解速度和养分释放的多寡，决定了森林生态系统的养分循环过程，也决定了土壤有效养分的供应情况。在凋落物分解过程中，胞外酶破坏了凋落物的结构组成并还原了有机C、N、P，凋落物分解过程是一个受制于土壤和凋落物中酶系统的复杂生物化学过程。目前的研究主要关注土壤酶活性，有关凋落物中酶活性的研究还相对较少。

酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)是土壤和植物体内及其凋落物一种重要的水解酶，其活性与土壤生态中碳、氮、磷等元素循环密切相关。已有研究表明，磷元素参与调控植物体内的多种营养和代谢，但磷元素多以难溶矿物态以及凋落物或腐殖质有机态等形式存在于土壤中，可溶性磷酸盐在作物与森林土壤中普遍缺乏，因此被认定为土壤生态系统植物生产力的限制因子。其中凋落物中有机磷的分解是土壤磷元素矿化的基础，是植物和微生物磷分的主要来源。土壤酸性磷酸酶能够水解凋落物中有机磷的磷酸酯或磷酸酐，加速凋落物有机磷矿化进程，提高土壤磷的移动性和有效性。因此，快速测定凋落物中酸性磷酸酶活性的高低及其变化，对了解凋落物降解的动态微观生态过程和土壤磷分有效性的管理具有重要意义，而提供一种操作便捷、灵敏度高和稳定性好的酸性磷酸酶活性检测方法是解决问题的关键。

由于分离技术和经济条件的限制，目前直接从凋落物中提取酸性磷酸酶尚有一定的难度。我国凋落物中酸性磷酸酶活性测定方是在土壤酶学方法基础上的延伸，但测定方法存在着指导方法笼统、操作步骤粗放、理念落后和结果易受干扰等诸多问题。其中以硝基苯磷酸二钠基质为底物进行酶解的色原底物法，灵敏度较磷酸苯二钠比色法有很大提高，但同样受缓冲液类型及其pH影响较大，且降解凋落物中腐殖质的水解干扰比色结果。相较传统酶活测定方法，微孔板荧光法已经较为广泛的应用在土壤酸性磷酸酶活性检测，比如《秦岭辛家山不同林分土壤微生物群落的季节动态》、《长期不同施肥对红壤碳、氮、磷循环相关酶活性的影响》、《生物质炭对盆栽黑麦草生长的影响及机理》均有涉及微孔荧光法，该方法具有孵育时间缩短、操作快速灵敏等特点。但由于土壤胶体的复杂性和吸附特性等复杂环境，需要配制大量土壤均质悬浊酶液，或分别测定样品微孔、空白微孔、阴性对照微孔、参考标准微孔和淬火微孔的荧光检测指标，并进行繁琐的公式计算，因此该方法并不能直接适用于凋落物中酸性磷酸酶活力测定。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种检测凋落物酸性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：

1)在待测凋落物碎屑中加入培养缓冲液，低温孵育，离心收集滤液，进一步稀释得到酶活性液；

2)取部分酶活性液高温灭活，制得灭活酶液；

3)制作MUB浓度与吸光值之间关系的标准曲线；

4)将酶活性液和灭活酶液分别添加到酶活性孔和阴性对照孔，然后加入4-MUB-β-D-磷酸酯工作液，避光震荡孵育，反应结束后加入终止液终止反应，在检测条件下，读取荧光值；