[发明专利]一种检测凋落物漆酶活性的方法

权利要求书

1.一种检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将待测凋落物剪碎过2mm筛，每个样品称取3个0.15g分别加入3个离心过滤管中，分别加入600μL pH4.5的培养缓冲液，在4℃下孵育60min后，4℃下16000×g离心30min得到酶滤液后并混合，用培养缓冲液调节体积至4mL，制得酶活待测液；

2)从步骤1)制备的酶活待测液吸取1mL，在避光条件下85℃加热2h，冷却至室温，得到灭活酶液；

3)在酶标板上，将80μL酶活待测液加入样品孔；将80μL灭活酶液加入阴性对照孔；再将80μL体积1330μM ABTS底物工作液加入到所述样品孔和阴性对照孔中；在避光22℃的条件下160rpm震荡孵育反应30min后，迅速放置于冰盒内终止反应；

4)采用多功能酶标仪，测定420nm波长下步骤3)反应体系的吸光值OD；

5)计算待测稀释酶液的稀释因子F＝(160μL*4mL)/(80μL*V)，160μL为上机测试液的体积，即80μL酶液+80μL ABTS工作液体积；4mL为样品酶液总体积，即酶活滤液用培养缓冲液调节后的体积；80μL为加入的待测稀释酶液体积，V为离心过滤管高速离心后酶滤液的混合体积；

6)计算待测样品的比酶活＝(OD活-OD阴)*F/(V酶*t*m)，单位为U/L/g，U为单位酶活力，即每分钟使OD增加1.0所需的酶量，OD活为待测稀释酶活反应液的吸光值，OD阴为样品对照灭火酶液的吸光值，V酶为加入的待测稀释酶液体积0.08L，t为反应液震荡孵育时间30min，m为测试样品凋落物的干重，即将3个离心过滤管连同其中的凋落物烘干后得到的重量除去离心过滤管的自重，单位g。

2.根据权利要求1所述的检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养缓冲液，其制备方法为：将3.025g Tris、3.9g马来酸、3.5g柠檬酸或3.825g一水柠檬酸、1.56g硼酸和122mL 1M氢氧化钠，用去离子水定容至250mL制备得到通用缓冲液原液；再将100mL所述通用缓冲液原液用盐酸调至pH 4.5，用去离子水定容至1000mL，灭菌后4℃备用。

3.根据权利要求1所述的检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，步骤3)中所述酶活待测液加入样品孔，是3次重复；所述灭活酶液加入阴性对照孔，是1样1孔。

4.根据权利要求1所述的检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，步骤3)中所述1330μM ABTS工作液制备方法为：称取73.17mg ABTS溶入100mL培养缓冲液中，4℃避光贮存4周内备用。

5.根据权利要求1所述的检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的枯枝或落叶，经过杀青和烘干后，放入尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝或落叶，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。

6.根据权利要求5所述的检测凋落物漆酶活性的方法，其特征在于，所述待测凋落物，其制备方法为：采集森林中构成林分特征树种的直径为5mm的枯枝，经过105℃杀青15min，80℃连续烘干48h后，称取7～10g放入300目10cm*8cm尼龙分解袋中，并将其埋入所述森林中，即在距离树主干1m用原表层0-10cm土壤覆盖并轻轻压实，埋藏至预设时间后，取出处于半降解的枯枝，去掉泥沙杂质，即为待测凋落物。