[发明专利]一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法

说明书

本发明提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，待芽长出后移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，后，再在优化培养基M13上诱导外植体长愈伤，即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。该转化方法与传统番木瓜转化相比，直接使用预培养的下胚轴作为外植体，避免了愈伤诱导后扩繁的4‑5个月时间，显著缩短转化周期。本发明所述方法所需设备简单、操作技术容易掌握，具有广阔的开发应用前景。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法。

背景技术

番木瓜是一种主要的热带水果，也是鲜果市场上的主要供应水果。番木瓜同时也被加工成饮料、果酱、干果和甜点，其青果、叶片和花也可以作为蔬菜(Watson,1997)。目前番木瓜的育种主要采用传统育种，由于制约着番木瓜的生产的主要为番木瓜环斑型花叶病毒病，我们用常规杂交方法难以赋予番木瓜栽培品种以野生番木瓜中的抗性特性，提高番木瓜产量，改良番木瓜品质仍是当前重要任务。我们通过转基因技术可以定向的改变植物的抗性，产量，品质等方面。但是由于现有的转基因方法中番木瓜诱导愈伤组织的周期很长，并且体系不是特别稳定，严重制约着番木瓜育种产业的发展。因此建立一种简单高效的番木瓜转基因方法，对番木瓜分子育种及基因功能研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备及转化方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种番木瓜下胚轴农杆菌转化受体的制备方法，将番木瓜种子消毒后，先后浸泡于NaClO溶液和KNO3溶液中，再转移到含有抗生素的无菌水中萌发长芽，再移植到琼脂培养基中黑暗培养至长苗，将苗的下胚轴经伤口膨大处理即得所述的番木瓜下胚轴农杆菌转化受体。

作为进一步改进的，所述消毒为在无菌环境中，将番木瓜种子先后经过体积浓度为70～80％的酒精、体积浓度为3～4％的NaClO溶液和质量浓度为0.05～0.15％氯化汞消毒，用无菌水清洗数次，这种消毒方式显著抑制了木瓜内生菌的繁殖。

作为进一步改进的，所述浸泡为将番木瓜种子浸泡在体积浓度为18～22％的NaClO溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床3.5～4.5h；然后将番木瓜种子从NaClO溶液中取出，用无菌水清洗数次，浸泡在浓度为0.5～1.5mol/L的KNO3溶液中，置于25～30℃、160～200rpm的摇床20～26h，番木瓜种子经过KNO3的处理，显著提高了种子的萌发率。

作为进一步改进的，所述抗生素为浓度为450～550mg/L的羧苄青霉素。

作为进一步改进的，所述萌发长芽为将番木瓜种子从KNO3溶液中取出，用无菌水清洗数次，放入含有抗生素的无菌水中，置于28～32℃，110～130rpm摇床，每天更换含有抗生素的无菌水，直至番木瓜种子出芽，这种方法保证了种子萌发过程中不被污染。

作为进一步改进的，所述伤口膨大处理为当待黑暗生长的苗高度达8～10cm，顶端的两片子叶张开时，取其下胚轴切成8～10mm小段置于K4培养基上培养5～7天，伤口膨大处理对于转化的成功，转化后诱导愈伤的形成非常关键。

作为进一步改进的，所述K4培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加激动素0.5mg/L。

作为进一步改进的，所述M13培养基为：MS 2.215g/L，蔗糖30g/L，2,4-D 5mg/L，植物凝胶3～3.6g/L，pH 6.0～6.2，高压灭菌后加脯氨酸0.7mg/L，脯氨酸对于显著缩短愈伤生长周期具有重要作用。