[发明专利]携带乙型肝炎病毒基因的重组甲型流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种携带乙型肝炎病毒基因的重组甲型流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。本发明的重组甲型流感病毒以甲型流感病毒为载体，利用反向遗传学技术，将乙型肝炎病毒基因整合到流感病毒基因组上，可以使重组流感病毒在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于乙型肝炎疫苗开发、相关药物的开发以及利用鸡胚或细胞作为生物反应器生产乙型肝炎相关蛋白。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体是指一种携带乙型肝炎病毒基因的重组甲型流感病毒、宿主细胞及其制备方法与应用。

背景技术

流感病毒属正粘病毒科正粘病毒属分节段的单股负链RNA病毒，病毒基因组约13.6kb，分为8个大小不等的独立片段，编码流感病毒的结构蛋白(PB1、 PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2)和非结构蛋白(NS1、NS2)。其中，PB1、PB2和PA组成病毒的聚合酶，核蛋白NP作为支架结构和vRNA结合。流感病毒编码两种表面糖蛋白：血凝素HA和神经氨酸酶NA。HA可吸附于宿主细胞表面的唾液酸变体，促进病毒感染细胞；NA则在病毒包装完成后促进病毒从感染细胞释放。根据HA和NA抗原性的不同，研究人员对已发现的A型流感病毒进行分类。基质蛋白2(M2)也是一种表面蛋白，其构成病毒的质子通道。基质蛋白1(M1)和非结构蛋白2(NS1)参与病毒vRNP复合体的输出过程。非结构蛋白(NS1)是病毒编码的宿主天然免疫反应的拮抗剂。

RNA病毒的反向遗传学是利用病毒的遗传物质，在易感细胞或宿主中重新拯救出病毒样颗粒或活病毒。该技术通过构建RNA病毒的感染性cDNA分子克隆，在DNA分子水平上对RNA病毒进行体外操作，研究病毒的结构和功能、复制调控机理、致病机理及病毒和宿主的相互关系等。1978年第1例RNA病毒Q β噬菌体经RNA病毒反向遗传系统被成功拯救，自此RNA病毒反向遗传系统得到建立和发展，各类RNA病毒的分子生物学研究取得了巨大进展。流感病毒的反向遗传学技术经历了依赖辅助病毒的参与到不依赖辅助病毒的十二质粒系统、八质粒系统，越来越成熟、广泛地应用于病毒基础性研究(李呈军,陈化兰.反向遗传学技术在流感病毒研究和防控中的应用[J].中国科学:生命科学,2015,45(10):1051-1066.)。

全球目前约有2.57亿慢性HBV感染者，主要集中在东南亚及非洲热带地区，已经成为世界范围内广受关注的公共卫生问题(WHO.Hepatitis B fact sheets[EB/OL].(2019-07-19)[2019-07-01].

Http://www.who.Int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b.)，现阶段我国约有9000 万慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者约有2000万～3000万(Razavi-Shearer D,Gamkrelidze I,Nguyen M H,et al.Global prevalence,treatment,and prevention of hepatitis B virus infection in 2016:a modellingstudy[J]. The Lancet GastroenterologyHepatology,2018,3(6):383-403.)。

疫苗接种是预防和控制人类传染病的最有效措施。在过去的50多年中，乙肝疫苗的发展经历了血源性疫苗、基因工程疫苗、合成肽亚单位疫苗、DNA疫苗，为人类的健康作出了重要贡献。