[发明专利]检测华南虎或蜱虫内血液原虫的通用引物

说明书

本发明公开了一种检测华南虎或蜱虫内血液原虫的通用引物，包括两组引物Colp‑F1和Colp‑R1以及Colp‑F2和Colp‑R2，本发明设计的引物，可以增加快速筛检宿主以及中间宿主中血液原虫Colpodella的准确性与阳性比例，避免存在伪阳性的缺点，也可以减少不必要的测序时间与金钱的浪费，并对于快速筛检宿主以及中间宿主中血液原虫Colpodella有很大的帮助。

技术领域

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及检测华南虎或蜱虫内血液原虫Colpodella的通用引物。

背景技术

目前侦测血液原虫Colpodella 所用的通用引物甚少，目前为止只有两组通用引物 (Piro1-S和Piro3-AS与PIRO-B和PIRO-A), 在国际SCI文献上也无列出。基于华南虎是我国特有的虎亚种，在自然界中是无可替代的存在，具有极高的研究价值，因此开发用于检测Colpodella 的通用引物并利用巢式PCR技术去检测华南虎血液或者防控可传染、致病强携带此病原的蜱虫是当务之急, 也是预防华南虎濒临绝种的方式之一，更可以做为流行病学调查的数据依据。

但是，利用巢式PCR技术去检测华南虎血液中血液原虫Colpodella，存在伪阳性的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测华南虎或蜱虫内血液原虫Colpodella的通用引物，增加快速筛检宿主以及中间宿主中血液原虫Colpodella的准确性与阳性比例，避免存在伪阳性的缺点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

检测华南虎或蜱虫内血液原虫Colpodella的通用引物包括设计的两组引物，具体如下：

第一组引物:

Colp-F1: 5’- GCTGGCACGACAGGTTTCCC-3’；

Colp-R1: 5’-CCGCACAGATGCGTAAGGAG -3’；

第二组引物:

Colp-F2: 5’-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3’；

Colp-R2: 5’-GGTACCCGGGGATCCTCTAGAG-3’。

采用所述的检测华南虎或蜱虫内血液原虫Colpodella的通用引物的巢式PCR鉴定方法，包括以下步骤：

1）以华南虎血液样品或蜱虫样品基因组DNA为模板，以权利要求1中所述的Colp-F1和Colp-R1为第一轮引物，进行第一轮PCR；

2)以第一轮PCR产物DNA为模板，以权利要求1中所述的Colp-F2和Colp-R2为第二轮引物，进行第二轮PCR；

3)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

4)将第二轮PCR产物进行序列测定；

5)根据NCBI数据库中记载的血液原虫Colpodella基因序列，进行系统进化分析，最终得出样品鉴定结果。

进一步的，所述第一轮PCR的反应条件为：

94℃预变性5 min；

94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸30s，进行35个循环；

最后72℃延伸10 min。

进一步的，第二轮PCR的反应条件为：