[发明专利]一种血浆病毒组学的纳米孔三代测序检测方法

说明书

本发明提供一种血浆病毒组学的纳米孔三代测序检测方法。血浆病毒组学的纳米孔三代测序检测鉴定技术包括以下四个部分：血液样本病毒核酸制备和标准核酸内参的参入、纳米孔测序文库的构建、纳米孔实时测序和实时fastq文件的转换、生物信息学分析等四个步骤。这种纳米孔实时检测技术不仅可以快速检测血液样本病毒组，而且可以提高病毒的全基因组序列的覆盖率，达到快速检测血液样本病毒的目的。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，涉及一种血液病毒的检测方法。

背景技术：

血液生物安全是重大民生和公共安全问题，血液资源的供应安全保障是国家医疗卫生服务体系正常运行的根本保证。我国存在血液供需矛盾和输血传播疾病风险等日益突出的问题，而常规血液病原体四项筛查HBV、HCV、HIV及TP已不能满足临床用血的安全，目前关于血液病毒谱的研究，血液病毒分布情况国内外研究文献相对较少，因此研究高精度血液病原体特别是血液病毒的检测方法，是目前我国亟待解决的问题，也是世界前沿的发展方向。

常规血液病原体四项筛查HBV、HCV、HIV及TP是通过血液酶免的方法或PCR或RT-PCR定量或定性分析病毒核酸确证血液病毒感染的种类，但需要序列特异性抗体或特异性引物才能对病毒抗原或核酸进行检测，由于病毒的变异或低copy样本产生病毒漏检，并且其它可能致病的血液病毒没在常规检测项目内，所以血液病毒宏基因组检测，提取的病毒核酸经过非模板依赖性PCR扩增不仅可以检测已知病毒，而且可以检测未知病毒，大大提高检测灵敏度和特异性。而宏基因组检测的方法主要依赖高通量测序技术的二代和三代测序仪器广泛应用，目前纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的MinION纳米孔测序仪，被称为具有发展潜力的第三代测序技术，当下Nanopore纳米微孔技术主要用于培养的细菌、病毒或生物基因组的检测，具有单分子测序，核酸长度可超过150kb，测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等特点。本发明用Nanopore三代纳米测序技术应用于血液病毒谱的检测，是个全新的技术领域，存在的核心技术问题是人类宿主核酸的污染和检测需要的目标核酸量大。因此，本发明要解决的核心问题就是，用超速离心和鸡尾酒酶解的方法富集血液样品病毒并去除宿主核酸，然后提取病毒核酸加入已知核酸内参并应用相关的试剂构建测序文库，同时建立本地化的病毒数据库和程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析，同时把标准核酸内参作为实验整个流程的质控和灵敏度指标，为高通量血液病毒检测的确证提供了可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血液病毒的检测方法，该方法用于非诊断目的。

本发明所要解决的关键问题就是用超速离心结合核酸酶解的方法富集血液样品病毒并去除宿主核酸，然后提取病毒核酸并应用相关的试剂建立测序文库，同时建立标准核酸内参作为实验和分析整个流程的质控和灵敏度指标，并建立本地化的病毒数据库和程序化的生物信息学分析程序，达到实时检测和分析血液病毒的目的，为纳米孔血液病毒检测的应用提供了可能性。

本发明所述的检测方法，包括以下步骤：(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备和标准核酸内参加入，(2)纳米孔测序文库构建和验证，(3)文库上机及纳米孔实时测序，(4)生物信息学分析等四个步骤。

其中，(1)血液样本病毒富集和建库核酸制备及标准核酸内参加入：基于血液待检测样本病毒富集、病毒核酸提取及建库核酸制备及标准核酸内参加入；

其中，(2)纳米孔测序文库构建和验证：用PCR条码试剂盒(PCR Barcoding Kit)构建可用于纳米孔测序的核酸库，并验证；

其中，(3)文库上机及纳米孔实时测序：用Nanopore测序试剂盒(如EXP-FLP002)加入含有混合内参的混合样本库、上机实时检测；