[发明专利]一组梨果肉qRT-PCR内参基因及其引物和应用

说明书

本发明提供一组梨果肉qRT‑PCR内参基因及其引物和应用，分别是RABF2b、ALFIN‑like1、BPS1和ICDH1，其中BPS1和ICDH1可作为最优内参基因组合用于梨果肉基因表达分析。本发明基于基因组和转录组筛选出的4个新内参在梨果肉发育过程中表达稳定度优于传统内参基因(Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26‑18S rRNA)；从4个新内参中开发了一对BPS1和ICDH1内参组合，用于梨果肉发育过程中基因表达均化效果最佳；4个新内参及所开发的一对BPS1和ICDH1内参组合可应用于广泛梨品种的果肉发育过程的基因表达研究。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及4个可用于广泛梨品种果肉发育过程中基因表达分析的新内参，其中推荐BPS1和ICDH1作为最优内参基因组合用于广泛梨品种果肉发育过程的基因表达分析。

背景技术

梨(Pyrus L.)世界上最具经济价值的水果之一，大体可分为西方梨和东方梨两大类。由于砀山酥梨(P.bretschneideri)已完成基因组测序(～512Mb)，因此成为研究梨属植物的模式植物。梨果实发育过程分为坐果期，分裂期，膨大期，成熟期和衰老期。从植物学角度看，梨果实由种子、花托(果肉)、内果皮、中果皮及外果皮组成，是由花托发育而来的假果。膨大的花托变成梨果实的肉质部分，是其主要的食用部分。果实发育的调控机制是广大植物学家和育种工作者共同关心的问题，而这需要从广泛而全面的分子层面进行研究。基因表达定量分析是解决复杂的基因网络调控的关键。由于实时荧光定量PCR(Quantitativereverse-transcription PCR,qRT-PCR)的特异性、高灵敏度和可重复性，其成为基因表达分析的首要方法，而精确的转录均化是获得可靠的qRT-PCR结果的基础。因此，该方法需要特定实验条件下稳定表达的内参基因(Reference Genes，RGs)对靶基因进行数据均化，未能使用合适的RGs可能导致真实的基因表达量出现偏差和低重复率。

由于看家基因(Housekeeping Genes，HKGs)在细胞中的基础作用和稳定的表达水平，在qRT-PCR分析中常常将其作为均化目的基因表达量的RGs。目前，在梨果肉的qRT-PCR研究中，最常用的六个传统HKGs是Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA。然而，这些传统HKGs的表达稳定性并没有经过系统验证，仅仅是基于它们在任何条件下都有恒定的表达水平的假设，就被应用于梨果肉的研究。越来越多的证据表明，在一定条件下，包括在不同的发育阶段，传统HKGs的稳定性会出现相当大的波动。例如，传统HKGs在拟南芥种子和花粉中出现了较高的变异系数CoV值(衡量基因表达稳定性的指标，CoV值越低表达越稳定)。这说明，传统的HKGs并不能广泛适用于所有的实验条件，对特定实验条件下RGs的表达稳定性进行综合评估是十分必要的。为此，研究人员开发了geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder等软件，用于统计分析以筛选出表达最稳定的RGs。在前人的研究中，wu等人对梨果肉发育过程中的8个HKGs进行表达稳定性评估，最终推荐GAPDH和TUB-b2为最佳内参基因；而Imai等人的研究结果表明EF1α和TIP41是梨果肉基因表达研究中最佳RGs。

转录组分析广泛应用于植物复杂分子过程的研究。RNA-seq作为一种全局性的评估技术，以其大数据集、高通量和敏感性的优势提供了一个极具代表性的样品转录组快照。利用RNA-seq数据集来筛选在不同条件下稳定表达的RGs，已成功应用在拟南芥、小麦和番茄等植物中。目前，梨果肉的相关研究产生的大量RNA-seq数据集为筛选果肉的最理想RGs提供了丰富的资源。

现有技术存在的问题：

目前，在梨果肉研究中常使用的内参主要为Actin、EF1α、TUB、UBI、GAPDH和26-18SrRNA，这六个传统内参基因一般作为单内参在果肉发育过程中用于均化目标基因表达量。

主要缺陷在于：