[发明专利]副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法

说明书

本发明公开了副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别副溶血性弧菌的20个新特异性分子检测靶标，可根据靶标分子设计相应的引物组，并通过对待检物进行PCR，分析PCR产物的电泳结果即得到是否存在副溶血性弧菌。与现有技术相比，本发明可用于检测某些生化反应不敏感的菌株，弥补生化鉴定的缺陷，同时本发明提供了副溶血性弧菌更多的特异性分子靶标，弥补常见毒力基因靶标检测区分度不足的缺陷，更加具有实用性；本发明方法还具有操作简单、检测结果特异性好，结果判定简单的优点，对于食品中的副溶血性弧菌识别具有重要意义。

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及副溶血性弧菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种常见的食源性致病菌，已是我国引起食物中毒的首要因素。由于副溶血性弧菌嗜盐的特性，其主要分布在沿海和海洋水域等富盐的环境中，并附着在鳕鱼、沙丁鱼、鲭鱼、比目鱼、章鱼、虾、蟹、蛤蜊、龙虾、小龙虾、扇贝和牡蛎等海洋生物的体表生长。人们如果食用了被副溶血性弧菌污染的未煮熟的食物会引起食物中毒，其发病潜伏期一般为1～4天，引起以发热(约占中毒患者的27％)，恶心(71％)，呕吐(32％)，腹痛(82％)，腹泻(98％)等为主要症状的急性胃肠炎，严重者可发展成败血症，如若治疗不及时可引起死亡。

随着物流网络的日益完善，海产品市场流通愈加频繁，内陆地区的副溶血性弧菌检出也逐渐增多，因此该菌在我国乃至全球范围内呈现扩散趋势。由于消费者缺乏对海产品源致病菌危害的认识，会在不同程度上忽略食品加工操作的规范，例如生熟食加工和烹饪器皿的混合使用，这造成了不同类型食品的交叉污染。在对我国内陆水产市场中副溶血性弧菌的检测结果显示不同食品中该菌的检出率及致病性呈上升趋势：水产品中该菌的总污染率为68.78％，其中淡水产品的污染率高达32.78％，平均菌浓度为66.63MPN/g；罗非鱼为该菌最常污染的鱼类；海产品为36％，海虾中的检出率最高。对于非水产品中副溶血性弧菌的检出率分别为：猪肉4.81％、牛肉2.17％、鸡肉6.66％、鸭肉1.21％、禽蛋及其制品5.51％。河鲜、海鲜类产品不再是副溶血性弧菌的唯一携带者，食物链中越来越多的其他类型食品成为副溶血性弧菌感染人体的新媒介。近年来在我国由副溶血性弧菌引起的食物中毒案例已经超过沙门氏菌，居于由食源性致病菌引起的食源性疾病首位(副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展，市售海水产品副溶血性弧菌带菌状况调查)，在不同类型食品中广泛的开展副溶血性弧菌的危害分析和风险评估迫在眉睫。

副溶血性弧菌的检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.7-2013)，该方法结果较为准确，检测时间较长(一周左右)、操作复杂(预增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴定)、成本高，且灵敏度较低可能会出现漏检结果。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。

目前，国内外PCR检测方法对上述副溶血性弧菌检测的分子检测靶标及引物已有一定的报道，通常采用副溶血性弧菌常见的特异性毒力基因tdh，tlh，trh，toxR和VP1332基因作为检测靶标。但是副溶血性弧菌的毒力基因与弧菌弧菌家族的其他物种均表现出不同程度的同源性，并且根据临床菌种测序结果统计发现不含有毒力基因的副溶血性弧菌依然对人体健康存在危害，因此通过毒力基因靶标还不能较好的实现副溶血性弧菌的精准筛查。根据我们目前已有报道的特异性、灵敏度高的基因靶标中十分少，难以满足实际检测的需要，基于原有的副溶血性弧菌分子靶标的精准鉴定面临了巨大的挑战；因此寻找新型特异性靶标分子用于副溶血性弧菌快速、精确检测具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的特异性新分子靶标及其快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别副溶血性弧菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～20所示。