[发明专利]一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针及制备方法

权利要求书

1.一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述胶原多肽探针的序列为：FAM-Ahx-(GPO)₇-(Asp)₆-NH₂、6-ROX-Ahx-(GPO)₇-(Asp)₆-NH₂、FAM-Ahx-(GPO)₇-(Gly-Asp-Asp)₃-NH₂、FAM-Ahx-(GPO)₇-(Gly-Asp-Asp)₂-NH₂。

2.如权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；

b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；

c)将N端由Fmoc保护的氨基酸4eq与HOBt 4eq和HBTU 4eq由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 6eq，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；

d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，然后向反应器中加入20-30％乙酸酐，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；

f)称取功能物质4eq、HOBt 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；或称螯合物质4eq、HOBt 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反应12-48hrs；

g)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-5次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为95:2.5:2.5，反应1-6hrs；

h)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽；

i)螯合物修饰肽溶解于缓冲液中，加入到缓冲液溶解的金属纳米功能物质中，肽：功能物质＝1：100，反应2-12hrs；

j)将反应液于缓冲液中透析24-48hrs。