[发明专利]一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，所述检测方法为非疾病诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

 (1)制备DNA 功能化纳米金探针：

将巯基修饰的金黄色葡萄球菌适配体2和引发链修饰在纳米金表面，得到DNA修饰的纳米金粒子探针，其中，所述金黄色葡萄球菌适配体2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，适配体2的5’端具有巯基修饰基团；所述引发链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，引发链的5’端具有巯基修饰基团；

(2)制备适配体修饰磁性纳米颗粒：

通过戊二醛法将氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒与链霉亲和素偶联，通过生物素-亲和素系统，将生物素化金黄色葡萄球菌适配体1固定于链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒表面，得到适配体功能化的磁性纳米颗粒，其中，所述金黄色葡萄球菌适配体1的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，适配体1的5’端标记有biotin；

(3)合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：

根据杂交链式反应原理，合成用于杂交链式反应的发夹探针H1和发夹探针H2的序列，并将发夹探针H1和发夹探针H2的一端标记生物素，得到生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，其中，所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其5’端标记有biotin；所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其3’端标记有biotin；

(4)制备HCR 反应产物：

将步骤（3）中合成的生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，与步骤（1）中制备的DNA 功能化纳米金探针混合，引发杂交链式反应，在纳米金表面生成杂交链式反应产物，其中，生物素化发夹探针Bio-H1和生物素化发夹探针Bio-H2，与步骤（1）中制备的DNA 功能化纳米金探针的体积比为1:1:1；

(5)检测靶标：

将步骤（2）中制备的适配体功能化的磁性纳米颗粒置于杂交液中，杂交液为0.01 mol/L PBS，与金黄色葡萄球菌混合，孵育，加入HCR反应产物，孵育，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶溶液，TMB显色，加入终止液终止反应，终止液为2.0 mol/L 的H2SO4溶液，根据吸光值大小与金黄色葡萄球菌浓度的对应关系，获得待测液中金黄色葡萄球菌的浓度。

2.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中纳米金粒子的粒径为15~25 nm。

3.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为30~50 nm，Fe3O4磁性纳米颗粒与链霉亲和素的偶联质量比为20:1，加入生物素化金黄色葡萄球菌适配体1的终浓度为100nM~500nM。

4.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中杂交链式反应的时间为1~2h。

5.根据权利要求1所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中杂交液的pH值为7.4，适配体功能化的磁性纳米颗粒与金黄色葡萄球菌的孵育时间为30~60 min，反应产物的孵育时间为30~60 min，链霉亲和素标记的辣根过氧化酶溶液的浓度为0.01~0.05 U/mL。

6.如权利要求1～5任一项所述基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法在食品安全、环境监测中的检测应用。