[发明专利]一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法

说明书

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产用酶组合物及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。本发明所述酶组合物由腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶组成。四种酶合理组合可以高效催化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明所述酶组合物可循环利用，成本低，节能环保。本发明所述酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法以腺苷为底物，通过添加所述酶组合物，可以低成本、安全可靠制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，也称为二磷酸吡啶核苷酸(缩写为DPN)，或辅脱氢酶I或辅酶I。在哺乳动物体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，氧化型(NAD⁺)在260nm处具有最大紫外吸收光谱，通过各种脱氨酶，从底物中接受一个氢原子和一个电子，变成还原型(NADH)，在340nm处有最大吸收。研究表明，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，能促进物质代谢、能量代谢、抵抗细胞衰老和抗氧化作用(ying,W.2008:Antioxid Redox Signal 10(2):179-206)，对机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。此外，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与疾病的发生密切相关(Sauve,A.A.2008.JPharmacol Exp Ther324(3):883-893)。

目前，NAD的合成主要有化学法、化学酶法和生物发酵法。化学法以烟酰胺为原料，经多步合成NAD，反应路线长，用到昂贵的试剂和大量有机溶剂造成环境污染。化学酶法以烟酰胺核糖为原料，同样会用到昂贵试剂和易爆试剂，成本高，且容易发生危险事故。生物发酵法工艺技术成熟，但是原料耗费巨大，消耗能源大，且产量有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种酶组合物，由腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶组成。

本发明所述酶组合物中腺苷激酶(AK)、腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NmPRT)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)四种酶合理组合可以用于酶解催化合成NAD。

在一些实施方案中，所述的酶组合物中所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的质量比为1:(1-3):(1-2):1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:1:1:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:2:1:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:1:2:1。在一些具体实施例中，所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的比例为1:3:1:1。

本发明所述酶组合物中所述腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶为采用基因工程技术通过PCR扩增目的片段、与载体连接转入宿主菌后诱导蛋白表达获得的相关酶制剂。所述酶制剂可以是粗酶液或者干粉，也可以是再经固定化处理后的固定化酶或者固定化重组细胞。