[发明专利]一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，本发明首次公开了可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含一对GRB2 mRNA甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，GRB2 mRNA的高甲基化与肝癌的恶性程度显著相关，通过检测GRB2 mRNA的甲基化程度，为恶性肝癌辅助诊断提供新的思路。

技术领域

本发明涉及一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，属于辅助诊断恶性肝癌的检测试剂盒技术领域。

背景技术

肝癌是肝脏部分的肿瘤病变，分为原发性肝癌和继发性肝癌。原发性肝癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，位于临床恶性肿瘤发病率第5位，病死率更是高居第3位，但对其发病分子机制尚不完全清楚。目前，肝癌的筛查主要应用甲胎蛋白(AFP)、超声和其它影像学结合的诊断技术，但超声或影像学手段受到技术设备或费用的限制，无法广泛应用。AFP被临床广泛认为是诊断肝癌的首选血清标志物，但对早期肝癌的检出率不高，其诊断准确性及敏感性均不太令人满意。因此，有必要探索更多的分子检测指标，对肝癌患者做到及早诊断，提高肝癌患者总体生存率。

GRB2是包含SH2功能域的接头蛋白，它在致癌基因Ras的信息传导途径中起着关键的作用，被认为是抗肿瘤药物设计的优秀靶标。GRB2在多种肿瘤中高表达，如膀胱癌、乳腺癌和肝癌，并且GRB2的表达与预后不良密切相关。近年来，RNA甲基化被证实参与调控肿瘤的发生与发展。研究表明，癌相关基因RNA的高甲基化能促进结肠癌的发生，并于预后低生存率密切相关。癌细胞的低分化与癌细胞的恶性程度呈高度相关，即分化越低的癌细胞恶性程度越高。我们在肝癌中同样发现了癌相关基因GRB2 mRNA的异常高甲基化，并发现它与肝癌的恶性程度显著相关。本专利所涉及的试剂盒和方法提供了一种高效的GRB2 mRNA甲基化检测途径，方便快捷地在分子水平上实现对肝癌的恶性程度进行辅助检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷和不足，在上述研究的基础上，提供一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒及其应用，其中GRB2mRNA甲基化水平在肝癌中显著高于正常肝组织，可通过对样本RNA甲基化水平测定辅助诊断肝癌。

本发明的目的是这样实现的，一种可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒，包括GRB2 mRNA甲基化特异性扩增上游引物、GRB2 mRNA甲基化特异性扩增下游引物及其GRB2 mRNA甲基化特异性测序引物，其中所述的GRB2 mRNA甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

5’-TGTTTAGGGTGTAGTGTGAGTGT-3’；

所述的GRB2 mRNA甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

5’-Biotin-ACTTCCTCCTCCACTCTCCTTATCTA-3’；

所述的GRB2 mRNA甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’-AAGAGGGAAGGTGAT-3’。

上述可用于检测与肝癌相关的GRB2基因mRNA甲基化程度的试剂盒的应用，其特征在于：该试剂盒可用于恶性肝癌辅助诊断，具体步骤为：

1)、从待检测组织样本中提取RNA；

2)、将提取的RNA进行重亚硫酸盐修饰；

3)、将重亚硫酸盐修饰后的RNA逆转录成cDNA；

4)、将获得的cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列为引物序列，进行PCR扩增反应；