[发明专利]基因工程化大肠杆菌及吲哚-3-乙酸的制备方法

权利要求书

1.一种基因工程化大肠杆菌，其特征在于，所述的基因工程化大肠杆菌由基因工程化大肠杆菌重组质粒转化至大肠杆菌获得，所述基因工程化大肠杆菌重组质粒由色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因和大肠杆菌质粒重组得到；

其中，所述的大肠杆菌质粒为pTrc99A，所述的大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli） MG1655，所述的色氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:17所示，所述二胺氧化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:18所示，且所述的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:19所示。

2. 一种权利要求1所述的基因工程化大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤；和

（2）转化所述基因工程化大肠杆菌重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤包括：

使用第一引物以色氨酸脱羧酶基因为模板扩增得到色氨酸脱羧酶基因扩增物，使用第二引物以大肠杆菌质粒为模板扩增得到大肠杆菌载体骨架，将色氨酸脱羧酶基因扩增物和大肠杆菌载体骨架连接，得到第一重组载体；其中，所述的第一引物和第二引物中含有匹配的同源臂；

使用第三引物以二胺氧化酶基因为模板扩增得到二胺氧化酶基因扩增物，使用第四引物以第一重组载体为模板扩增得到第一重组载体扩增物，将二胺氧化酶基因扩增物和第一重组载体扩增物连接，得到第二重组载体，其中，所述的第三引物和第四引物中含有匹配的同源臂；

使用第五引物以吲哚-3-乙醛脱氢酶基因为模板扩增得到吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物，使用第六引物以第二重组载体为模板扩增得到第二重组载体扩增物，将吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物和第二重组载体扩增物连接，得到第三重组载体；其中，所述的第五引物和第六引物中含有匹配的同源臂；

分别使用第七引物和第八引物以第三重组载体为模板扩增得到含有tac启动子序列的扩增物和第三重组载体扩增物，将含有tac启动子序列的扩增物连接在第三重组载体扩增物的色氨酸脱羧酶基因之前，得到基因工程化大肠杆菌重组质粒；其中，所述的第七引物和第八引物中含有匹配的同源臂。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一引物的碱基序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述第三引物的碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述第四引物的碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所述第五引物的碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述第六引物的碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述第七引物的碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述第八引物的碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

4.一种吲哚-3-乙酸的制备方法，其特征在于，包括使用如权利要求1所述的基因工程化大肠杆菌的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用所述的基因工程化大肠杆菌催化色氨酸，获得吲哚-3-乙酸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述的基因工程化大肠杆菌先在包含氨苄青霉素的液体培养基中培养，得到第一培养液；将至少一部分第一培养液在无氨苄青霉素的液体培养中培养，获得第二培养液；

（2）向第二培养液中加入异丙基-硫代半乳糖苷继续培养，获得第三培养液，收集第三培养液中的菌体；

（3）将收集的菌体用缓冲液重悬，形成悬浮液；然后向悬浮液中加入色氨酸，反应得到吲哚-3-乙酸。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，第二培养液在600nm波长处的吸光值OD₆₀₀为0.1～1；第三培养液的OD₆₀₀为2～6；缓冲液为Tris-HCl缓冲液；色氨酸以浓度为1～4g/L的色氨酸溶液的形式加入。