[发明专利]一种用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂和试剂盒

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂和试剂盒。该用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂包括热启动DNA聚合酶、寡核苷酸链和PCR缓冲液，其中，寡核苷酸链的序列为：CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG。本发明提供的用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂和试剂盒敏感性好、重复性好，性能稳定，此外采用口腔拭子免核酸提取的方法，直接上样扩增，省略了繁杂的核酸提取和纯化步骤，大量节约实验耗材和人力成本，操作简单，可适用于临床大规模使用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂和试剂盒。

背景技术

荧光定量PCR(也称FQ-PCR)是上世纪90年代后期研制出的一项技术。FQ-PCR引入特异的荧光探针，该探针与PCR引物对内侧的一段序列同源。探针的5’端标有报告荧光，而在3’端则标有淬灭荧光，当探针保持完整时，报告荧光发出的发射波长被淬灭荧光的激发波长吸收，此时检测不到报告荧光的荧光信号；在PCR进行过程中，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切核酸活性可以将荧光探针切成单个碱基，使报告荧光不再受淬灭荧光的影响，报告荧光的荧光信号可被检测到，并随着PCR循环数的增加而增加。由于整个实验过程都是在完全封闭的系统中运行，避免了交叉污染，使得结果更加客观真实，同时在扩增时结合了特异探针的杂交，进一步提高了实验的敏感性和特异性，实时荧光PCR敏感度、灵敏度以及准确性等方面优势比较明显。目前，随着技术的更新迭代，荧光PCR技术在生物、医学、法医以及第三方检验机构中应用更加广泛。

口腔拭子样本(口腔脱落细胞)处理方式主要有以下几种处理方式：

1)离心柱法和磁珠法，这两种方法都要经过复杂的酶加热裂解、结合、洗涤、重复洗涤、洗脱等步骤，操作复杂，耗时1-2小时，且需要用到大量的有毒有害的有机试剂。同时核酸提取还需用到专业的实验室设备及环境，虽然部分实验室也配备了专门的核酸提取仪器，但仪器价格相对昂贵，后续提取试剂盒的成本也很高。

2)chelex100热裂解法，这个方法也是部分公司和专利采用的简易型的样本处理方式，同样需要100℃裂解10-20分钟，并有反复洗涤和离心的过程，因此还是无法实现真正意义上的直接荧光PCR扩增。

此外，目前针对口腔拭子样本直接取样进行荧光PCR扩增的试剂未见报道，因此，需要一种敏感性好、特异性高、准确可靠、核酸免提取的用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂。

发明内容

本发明为解决现有技术中的对口腔拭子进行荧光PCR扩增时，需要对口腔拭子样本进行复杂的核酸提取或纯化处理，而导致的操作复杂和成本高昂的问题，提出了一种用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于口腔拭子直接荧光PCR扩增的试剂，包括热启动DNA聚合酶、寡核苷酸链和PCR缓冲液。

进一步地，寡核苷酸链的序列为：CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG。

进一步地，寡核苷酸链的浓度为0.2-2uM。

进一步优选地，寡核苷酸链的浓度为200nM。

进一步地，热启动DNA聚合酶的适用pH为8.0-9.0。

进一步优选地，热启动DNA聚合酶的适用pH为8.5。

进一步地，热启动DNA聚合酶的的浓度为0.5U/μL。

进一步地，PCR缓冲液包括1×缓冲液和稳定试剂。