[发明专利]一种交联微球及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物组织工程细胞支架材料领域，涉及一种交联微球及其制备方法和应用。该方法先通过喷雾冷冻干燥方式制备出壳聚糖‑明胶物理混合微球，然后使物理混合微球中的氨基和羧基进行化学交联，从而制备交联微球。不仅解决了由单用喷雾冷冻方式导致的微球结构不稳定的问题，同时联用壳聚糖和明胶可以提高微球的细胞黏附特性，以其作为微载体可以提高细胞培养效率，既可二维静态培养，也可三维动态培养。本发明中的壳聚糖和明胶原料成本低，物理混合微球和化学交联微球的大规模生产成本低，且无有毒物质残留，可进行大规模细胞培养，在体内注射方面具有极大的应用前景。

技术领域

本发明属于生物组织工程细胞支架材料领域，涉及一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，通过该制备方法制得的微球，以及利用该微球作为细胞培养微载体的应用。

背景技术

近年来，在糖尿病、角膜病变、软骨组织损伤等疾病治疗方面，围绕细胞治疗(celltherapy)已获得大量研究成果，并且有一部分已应用于临床，具有极大的应用前景。而微载体培养技术(microcarrier culture technique)是实现贴壁细胞大规模培养的有效手段。目前，国外已实现部分实心或多孔微载体的商品化，如通用电气医疗公司(GE Healthcare)的Cytopore^TM、Cytodex^TM、Cytoline^TM等系列微球，以及康宁公司(CORNING)的可溶性微载体(DMC)等。与此同时，还有多种微载体正处于研究阶段。

与传统的平板培养法相比，微载体培养法能够使待培养的细胞在微载体上贴壁生长，实现大规模悬浮培养。适于细胞培养的微载体的尺寸约为100-400μm^(1,2)。但现有的微球制备技术在满足尺寸要求的前提下大多无法去除本身有毒性的物质，微载体应用仅限于细胞的体外培养。例如，康宁公司的中国专利申请CN 107849528 A中公开了一种符合尺寸要求的PGA-明胶微载体，但其制备过程中使用了戊二醛(对人体具有强烈的刺激作用)作为交联剂。因此，仍需开发既能满足用于细胞悬浮培养的尺寸要求，又无毒性残留物的微载体及其制备技术，用于大规模三维细胞的培养。

壳聚糖(chitosan，或称几丁聚糖)是一种储量极为丰富、生产成本低廉的天然多糖，主要来源于甲壳类动物(如虾、蟹等)的外壳以及某些真菌的细胞壁。壳聚糖是甲壳素(chitin，或称几丁质)的N-脱乙酰基产物，具有抗菌性能好、体内排异反应小、可降解吸收等优良特性，在医用敷料、人造组织、药物缓释载体等领域具有广泛应用，已被中国、美国等国家批准为药用辅料。然而，壳聚糖类微球多采用有毒的交联剂来合成，因此很难成为品质要求较高的药物的载体。例如，Chen等人采用戊二醛作为交联剂来制备壳聚糖微球⁽³⁾。常规喷雾加热干燥机在工作时，加热会导致液滴收缩，因此所得颗粒的尺寸不能达到上述细胞培养最佳的范围，且颗粒形貌很难控制。另一方面，部分壳聚糖由于其较高的粘度，冷冻喷雾干燥工艺不适于制备微球，限制了壳聚糖的广泛应用。

为了避免加热所造成的影响，Liang W.等人以及Wanning S.^(4,5)等人均采用喷雾冷冻法制备壳聚糖微球，采用液氮作为凝固浴，使微球保持球形，但不足之处在于，所得微球结构稳定性差。同时，采用液氮进行冷冻，工艺操作性差。基于其结构的不稳定性，该类微球多用于提高药物的溶解⁽⁶⁾。

作为药用辅料的明胶(gelatin)是胶原的变性产物，具有良好的生物相容性和可降解性，其降解产物氨基酸易被吸收。明胶的原料生产成本低，在胶囊、片剂包衣(糖衣)、代血浆、止血剂等领域具有广泛应用。此外，明胶的问题在于易溶于热水。例如，Kim等人将未交联的明胶球置于37℃水中，发现明胶完全溶解⁽⁷⁾。因此，尽管明胶含有RGD序列，可以很好地黏附细胞，可改善细胞黏附能力，但由于其溶解/溶胀导致结构稳定性差，在三维动态细胞培养中，微载体结构不稳定，甚至破碎，造成细胞黏附性变差。因此，人们亟需一种尺寸适宜、细胞黏附性能好、结构稳定的微载体用于细胞培养。

发明内容