[发明专利]一种能够反转PD-1免疫抑制信号的CAR T细胞结构EM1设计

说明书

本发明提供一种新型的CAR T结构能特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，同时还可反转PD1‑PDL1的免疫抑制信号，但又能对只表达PDL1的细胞不产生杀伤效应。其结构如附图2所示，其中1为CD19scfv(是可以识别肿瘤细胞所表达CD19蛋白的单链可变肽段)，2为连接段(用以链接CD19scfv和PD1的胞外段以及跨膜区)，3为PD1‑EM+TM(为PD1的胞外段和跨膜区，其中EM‑extramembrane指的是胞外段，TM‑transmembrane指的是跨膜区)，4为4‑1‑BB(为CAR T细胞的共刺激分子)，5为CD3ζ(为CAR T细胞的活化信号)。

技术领域

本发明属于一种新型的嵌合型抗原受体免疫(chimeric antigen receptor)T细胞的结构设计，不仅可以特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，而且还可以反转 PD1-PDL1免疫抑制信号，且不引起对仅表达PD-L1细胞的特异性杀伤的脱靶效应(on target offtumor effect)。

背景技术

嵌合型抗原受体T(chimeric antigen receptor T cell-CAR T)细胞是一种能够特异性杀伤表达肿瘤相关性抗原(tumor associated antigen-TAA)的T细胞，在肿瘤的免疫治疗中占比高达40％¹。CAR T细胞的基本结构从胞外到胞内依次为针对肿瘤相关抗原的单链可变区(Single chain variable fragment-scfv)，铰链区 (hinge)，跨膜区(Transmembrane domain-TM)和胞内段(Intracellular domain- IM)组成²。根据胞内段共刺激分子的不同，可将CAR T细胞分为一代CAR T细胞——只含有CD3ζ(为CD3复合体的一部分)的胞内段；二代CAR T细胞——含有一个共刺激分子(CD28或者CD137)；三代CAR T细胞——含有两个共刺激分子和四代CAR T细胞——在二代CAR T的基础上分泌可以促进CART 细胞活化和生长的分子³，其示意图附图1所示。附图1从左至右分别是一代 CAR T细胞、二代CAR T细胞、三代CAR T细胞、四代CAR T细胞。

目前CAR T细胞虽然在治疗B细胞肿瘤上，特别是针对急性淋巴细胞白血病上取得了良好的临床疗效，但是经典的二代CAR T细胞并不能有效控制高表达免疫抑制信号分子受体的肿瘤⁴。因此进一步的优化CAR T细胞的结构，使得 CAR T细胞能够抵抗免疫抑制信号，扩大CAR T的有效性是目前CAR T细胞亟待解决的课题。本研究针对CD19的肿瘤靶点，旨在设计出一种能够杀伤表达 CD19肿瘤靶点的CAR T细胞，同时可以反转PD1-PDL1免疫抑制信号的结构，但又不会杀伤仅仅只表达PDL1的正常细胞。

针对抑制PD1-PDL1的免疫抑制信号和CAR T细胞联合使用的想法，已经有了不少研究——有研究者直接将针对CD19的CAR T细胞和PD1单抗联合使用治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，其PD-1单抗可以刺激CAR T细胞的再次增殖同时确实可以加强肿瘤病灶的清除⁵，但是PD-1的全身广泛应用不仅可能会导致更多的免疫检查点抑制剂所使用所导致的不良反应的发生，而且也会加重治疗的成本；有研究者在CAR T的基础上设计出可以分泌PD1，PDL1的单抗也可以增强CAR T细胞的免疫活性^5,6；还有研究者在CAR T细胞上并联一个PD- 1(胞外段)CD28(跨膜区和胞内段)的嵌合蛋白，不仅可以阻断PD1-PDL1的免疫抑制信号，而且还可以将PD1接受到的免疫抑制信号转化成免疫活化信号，已达到增强CAR T细胞活性的作用，但是这样设计的CAR T细胞在杀伤既表达肿瘤相关抗原和PDL1的肿瘤细胞时会分泌更多的细胞因子，这样会进一步加重 CAR T在治疗过程中所导致的CRS的风险⁷。总结来说，EM1结构的CAR T细胞不仅能够反转PD1-PDL1的免疫抑制信号，而且还不会引起更多的细胞分泌，同时还没有造成在治疗肿瘤过程中额外经济负担的增加。

发明内容